Иммунологическая лабораторная диагностика ревматических заболеваний
пособие для врачей

Данный материал перенесен с форума "Компас здоровья" для обеспечения сохранности в связи с частичным удалением с сайта радикал картинок пользователя, разместившего данный материал на форуме и отсутствием ответа на запрос о сложившейся ситуации от владельцев ресурса.

Лапин Сергей Владимирович, к.м.н.
Тотолян Арег Артемович, д.м.н., проф.
Научно-Методический Центр МЗиСР
по Молекулярной Медицине
СП6ГМУ им. акад. И.П. Павлова

197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8
Тел./факс: (812) 499-71-94

Список сокращений [показать]

AКА — антикератиновые антитела ПР-3 — протеиназа 3 AНА — антинуклеарные антитела РА — ревматоидный артрит АНФ — антинуклеарный фактор РВ — реакция Вассермана АНЦА — (син. англ.: ANСА — anti-neutrophil cytoplasmic antibodies) — антинейтрофильные цитоплазматические антитела РИА — радиоиммунный анализ АПФ — антиперинуклеарный фактор РФ — ревматоидный фактор АФА — антифосфолипидные антитела СЗСТ — смешанное заболевание соединительной ткани (синдром Шарпа) (mixed connective tissue disease) АФС — антифосфолипидный синдром СКВ — системная красная волчанка АЦЦП (син. англ.: anti-ССР — cyclic citrullinated peptide) — антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептиду СРВ — С-реактивный белок АЭА — антиэндотелиальные антитела СС — системный склероз ВОЗ — Всемирная Организация Здравоохранения СЧГ — синдром Чарга-Штраусса ГВ — гранулематоз Вегенера СШ — синдром Шогрена ДБСТ — диффузные болезни соединительной ткани ТВП — тест волчаночной полоски (lupus band) ДКВ — дискоидная красная волчанка ЦИК — циркулирующие иммунные комплексы ДМ/ПМ — дерматомиозит/полимиозит ЭНА — экстрагируемые ядерные антигены ИФА — иммуноферментный анализ СL-ИФТ — иммунофлюоресцентный тест на Crithidia luciliae МЕ — международные единицы СRESТ-синдром (Calcinosis, Raynauld's phenomenon, Esophagitis, Sclerodactyly, Telangiectasia) — разновидность СС, объединяющая подкожные кальцинаты, синдром Рейно, нарушения моторики пищевода, склеродактилию и телангиэктазии МПО — миелопероксидаза slCAM-1 — растворимая форма межклеточной адгезионной молекулы-1 ос/дсДНК — одно-/двуспиральная ДНК sIL-2R — растворимая форма рецептора интерлейкина-2

1   2   3   4

ЛАБОРАТОРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ

Классификация

К иммунологическим тестам относятся те лабораторные тесты, которые прямо или косвенно отражают функции иммунной системы.

Принципиальные методические подходы,
использующиеся в диагностике ревматических заболеваний:
(методы иммунологической диагностики в ревматологии)

  1. Измерение концентраций сывороточных белков (например: СРВ, С3, С4).
  2. Измерение концентраций продуктов клеток иммунной системы (иммуноглобулины, цитокины).
  3. Измерение продуктов деградации молекул (например: С3d, В-сrosslap, гидроксипролин).
  4. Обнаружение генов иммунной системы (например: НLА-В27, shared epitope).
  5. Выявление аутоантител, их характеристика: мишень, клональность, класс Ig.
  6. Функциональные тесты (например: обнаружение криоглобулинов, волчаночный антикоагулянт).
  7. Иммуноморфологическое исследование ткани (например: волчаночная полоска, число СОЭ лимфоцитов в ткани, иммунофенотипирование клеток крови)

Прежде всего, к иммунологическим тестам относится измерение концентраций сывороточных белков, которые производятся печенью в ответ на воспалительную реакцию. К основным белкам воспаления, необходимость измерения которых неоспорима в практической лабораторной диагностике, относятся С-реактивный белок (СРВ), факторы системы комплемента — С3 и С4, фибриноген. Более детальное обсуждение их роли в диагностике будет приведено ниже.

Иммунокомпетентные клетки фосфолипидным секретируют большое количество молекул, которые являются потенциальными диагностическими маркерами. Клетки иммунной системы синтезируют иммуноглобулины, цитокины и ростовые факторы, ферменты, с их поверхности слущиваются рецепторы, которые могут быть обнаружены в крови.

В практической диагностике измеряются концентрации иммуноглобулинов, провоспалительные цитокины, а также ряд молекул, прежде всего, бета2-микроглобулин и неоптерин.

В ходе иммуноопосредованного воспаления многие молекулы подвергаются разрушению и протеолизу. Это приводит к появлению в крови и других биологических жидкостях продуктов деградации молекул. Целесообразно определять концентрации продуктов активации системы комплемента, что указывает на протекание тканевого воспаления. Ряд молекул, образующихся в результате деградации матрикса соединительной ткани, могут быть использованы как показатели разрушения суставного хряща в ходе иммунологического воспаления.

Наследственная предрасположенность лежит в основе аутоиммунных заболеваний. Врожденные особенности иммунного ответа определяются прежде всего генами системы основного комплекса гистосовместимости человека — генами системы НLА. Эта полиморфная система генов, кодирующих белки, участвующие в распознавании антигенов и индукции иммунных ответов. Определенные аллели достоверно чаще встречаются при аутоиммунных заболеваниях, что указывает на особенности презентации антигенов в иммунной системе. Именно нарушения в презентации антигена могут лежать в основе патологического иммунного ответа на собственные антигены.

Ряд других генов, кодирующих белки, которые выполняют ключевые роли в иммунной системе, также имеют несколько аллельных форм, например ген TNFα, однако необходимость их практического определения окончательно не установлена.

Антинуклеарные антитела и их классификация

Выявление антинуклеарных антител лежит в основе аутоиммунной лабораторной диагностики и представляет незаменимый инструмент ранней диагностики и идентификации основных ревматических заболеваний. Выявление антинуклеарного фактора является самым часто выполняемым клиническим анализом в практических иммунологических лабораториях, что отражает его значение для диагностики аутоиммунных заболеваний.

Антинуклеарные антитела (АНА) представляют собой семейство аутоантител, связывающихся с нуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками. Они встречаются более чем у 90% больных с диффузными болезнями соединительной ткани, такими как СКВ, СС, СЗСТ, СШ (табл. 7).

Таблица 7. Краткий перечень состояний, сопровождающихся АНА Группы обследованных Встречаемость АНА Системная красная волчанка 95% Системный склероз 95% Синдром Шогрена 95% Дерматомиозит, полимиозит 30-50% Смешанное заболевание соединительной ткани 100% Дискоидная красная волчанка 50-60% Локализованная склеродермия 50% Ревматоидный артрит 30-40% Юношеский ревматоидный артрит (олиго- и полиартритная формы) 50-90% Аутоиммунный гепатит 95-100% Первичный билиарный цирроз 95-100% Узелковый полиартериит 10-20% Злокачественные заболевания 10-20% Хроническое невынашивание беременности 10-15% Пожилые (>65 лет) 10% Здоровые женщины 5%

Представители этого семейства аутоантител могут быть обнаружены при множестве инфекционных, воспалительных и онкологических заболеваний. Разнообразие патологических форм, сопровождающихся появлением АНА, заставляет заподозрить единство иммунологических реакций в их патогенезе. В то же время встречаемость АНА достигает 1-5% у клинически здоровых людей и несколько возрастает у пожилых.

Несмотря на значительные успехи в изучении СКВ и родственных состояний в течение последних 5 лет, причины и механизмы формирования иммунного ответа в отношении рибонуклеопротеиновых антигенов остаются неизвестными. Основным механизмом индукции АНА, по всей видимости, является патологический апоптоз кератиноцитов, лимфоцитов и других клеток, который возникает при диффузных заболеваниях соединительной ткани. Апоптотические тельца, содержащие в своем составе антигены АНА, напоминают по структуре вирусные частицы и способны индуцировать специфический иммунный ответ.

Антитела могут иметь патогенетическое значение, что показано в отношении антител к дсДНК при СКВ с поражением почек, но большинство разновидностей АНА являются скорее вторичным феноменом по отношению к деструкции ткани при аутоиммунных заболевaниях.

К настоящему времени описано более 100 разновидностей АНА, направленных против нуклеиновых кислот, гистонов, белков ядерной мембраны, компонентов сплайсосомы, рибонуклеопротеинов, белков ядрышек и центромер (табл. 8 [показать] ).

Таблица 8. Перечень основных типов АНА, используемых для клинической диагностики ДБСТ Специфичность Тип свечения АНФ на клетках НЕр-2 Подтверждающие тесты Связь с ревматическими заболеваниями Ядерные антигены Хроматин-ассоциированные дсДНК периферический, гомогенный РИА, ИФА, РИФ СКВ дсДНА и осДНК периферический, гомогенный СКВ осДНК не выявляется ИФА СКВ, ДКВ, РА Ku гранулярный/ядрышковый ДИД, РИП, ИБ СКВ, СЗСТ PGNA/Ga/LЕ-4 ядерный/ ядрышковый гранулярный ДИД, ИФА, ИБ, РИП СКВ Ламины А,В,С периферический/ гомогенный ИФА Люпоидный гепатит Гистоны ИБ, РИА, ИФА Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 гомогенный, периферический Только Н3 крупногранулярный СКВ, ДКВ, РА, ПБЦ, СС Компоненты сплайсосомы крупногранулярный ДИД, ИФА, ИБ, РИП Sm СКВ U1 snRNP СКВ, СЗСТ, вСКВ U2 snRNP СКВ, СЗСТ, перекрестные синдромы U4/U6 snRNP СШ, СС U5 snRNP СКВ, СЗСТ U7 snRNP СКВ U11 snRNP СС Рибонуклеопротеины Ro/SS-A мелкогранулярный/нет ДИД, ИФА, ИБ, РИП СШ, вСКВ, СКВ, ПБЦ, СС La/SS-B мелкогранулярный ДИД, ИФА, ИБ, РИП СШ, ПККВ, вСКВ, СКB Mi-2 гомогенный ДИД, РИП ДМ/ПМ р80-койлин гранулярный СШ МА-1 гранулярный CШ Нуклеолярные РНК-полимеразы РИП, ИБ РНКп-I ядрышковый СС РНКп-II ядерный/ ядрышковый СС, СКВ РНКп-III ядерный/ ядрышковый СС Рибосомальный RNP ядрышковый, цитоплазматический ДИД, ИБ, РИП, ИФА СКВ топоизомераза 1 (Scl-70) гранулярный/ ядрышковый ДИД, ИБ, РИП, ИФА СС U3 snoRNP (фибриллярин) крупногранулярный ИБ, РИП CC Th snoRNP (Rnase MRP) мелкогранулярный РИП CC NOR90 (hUBF) 10-20 гранул в ядре ИБ, РИП СС Pm-Scl (PM-1) гомогенный/ ядрышковый ДИД, РИП, ИБ ДМ/ПМ, СС Цитоплазматические тРНК-синтетазы тРНКHis (Jo-1) диффузный цитоплазматический ДИД, РИП, ИБ, ИФА ПМ/ДМ тРНКThr (PL-7) диффузный цитоплазматический ДИД, РИП, ИБ, ИФА ПМ/ДМ тРНКAla (PL-12) диффузный цитоплазматический ДИД, РИП, ИБ, ИФА ПМ/ДМ тРНКGly (EJ) диффузный цитоплазматический ДИД, РИП, ИБ, ИФА ПМ/ДМ тРНКIle (OJ) диффузный цитоплазматический ДИД, РИП, ИБ, ИФА ПМ/ДМ SRP (сигнал-распознающая частица) не описан РИП, ИБ ПМ KJ не описан ДИД, ИБ Миозит Фактор элонгации 1 (Fer) не описан РИП Миозит тРНКSer (Mas) не описан РИП Миозит Примечания:

ДКВ — дискоидная красная волчанка, вСКВ — синдром врожденной волчанки, ПБЦ — первичный билиарный цирроз, ПККВ — подострая кожная красная волчанка, ДИД — двойная иммунодиффузия, ДМ — дерматомиозит, ИФА — иммуноферментный анализ, ИБ — иммуноблоттинг, ПМ — полиомиозит, РА — ревматоидный артрит, РИП — радиоиммунопреципитaция, РИФ — реакция непрямой иммунофлюоресценции, СЗСТ — смешанное заболевание соединительной ткани, СКВ — системная красная волчанка, СС — системный склероз, СШ — синдром Шогрена

Не выявляются на криосрезах ткани и большинстве перевиваемых клеточных линий, оптимальный субстрат — НЕр-2

Антитела к цитоплазматическим антигенам, выявляющиеся при попиомизите и дерматомиозите взрослых, также причисляются к АНА, так как они направлены против рибонуклеопротеиновых структур и в их возникновении предположительно участвуют сходные патогенетические механизмы.

Разнообразие типов АНА и уточнение клинико-лабораторных корреляций позволило использовать АНА как показатель, помогающий клиницисту уточнить прогноз, течение и, зачастую, предупредить обострение заболевания.

Для обнаружения АНА используется ряд показателей, которые могут измеряться с помощью разных методов (табл. 9).

Таблица 9. Показатели и методы выявления AНА Показатель Специфичность Метод Цель выявления LЕ-клетки Опсонизирующие АНА к ядрам клеток Функциональный тест Скриниг АНА Антинуклеарный фактор АНА против нерастворимых и конформационных антигенов Непрямая иммунофлюоресценция Скрининг АНА Антитела к экстрагируемому ядерному антигену Антитела против растворимых антигенов Двойная иммунодиффузия, контрэлектрофорез, ИФА Скрининг АНА Антитела к дcДНК АНА против нуклеиновых кислот ИФА, непрямая иммунофлюоресценция, радиоиммунный анализ Определение конкретных разновидностей АНА Антитела к рибонуклеопротеинам Ядерные мишени АНА: Sm, RNP, SS-A, SS-B, JO-1, Scl-70 и др. Двойная иммунодиффузия, контрэлектрофорез, ИФА, иммуноблоттинг, радиоиммунный анализ Определение конкретных разновидностей АНА

Общее содержание АНА в сыворотке крови больных измеряется лабораторным показателем, который называется "антинуклеарный фактор" (АНФ). Учитывая высокую чувствительность обнаружения АНФ, нередко проводят равенство между присутствием АНА в крови больных определенными заболеваниями и положительным результатом лабораторного обследования для обнаружения АНФ.

Традиционно под названием АНФ подразумевают результат иммунофпюоресцентного теста для обнаружения АНА. Другие методы обнаружения АНА, например метод ИФА, значительно уступают непрямой иммунофлюоресценции по чувствительности.

Не рекомендуется называть термином "АНФ" показатели, определяемые другими методами. Также немаловажно указывать субстрат выявления АНФ, например "криосрезы почки крысы" или "клеточная линия НЕр-2", а также границу нормы в виде титра. Это позволяет сориентироваться в диагностическом значении результата теста, так как он в значительной мере зависит от субстрата обнаружения АНФ и исходного титра сыворотки.

Присутствие в сыворотке крови АНФ обуславливает обнаружение в крови клеток, характерных для красной волчанки (LЕ-клеток). Таким образом, LЕ-клетки также можно рассматривать в качестве вторичного показателя, указывающего на наличие АНА. Низкая чувствительность и плохая воспроизводимость тестов, используемых для обнаружения LE-клеток, не позволяет им на равных конкурировать с АНФ, и постепенно LЕ-клетки полностью вытесняются серологическими методами обнаружения АНА.

Номенклатура конкретных разновидностей АНА зависит как от ядерных мишеней аутоантител, так и методов, с помощью которых они обнаруживаются. Отдельно выделяют АНА, реагирующие с нуклеиновыми кислотами, прежде всего с ДНК; антитела к водорастворимым антигенам, которые могут быть экстрагированы водно-солевыми растворами, — антитела к экстрагируемому нуклеарному антигену (ЭНА); антитела к нерастворимым в воде антигенам, а также информационные антигены, которые разрушаются при препаративном выделении из ядра клетки. Два последних вида аутоантигенов не могут быть получены в очищенном виде, поэтому единственным объективным методом их обнаружения является АНФ с описанием типа свечения ядра клетки.

Уточнение антигенных мишеней АНА зависит от антигенного субстрата, который применяется в иммунологических тестах. Антиген-содержащий субстрат может быть нативным, то есть полученным при минимальной очистке, либо высокоочищенным из ткани с помощью биохимических методов. Кроме того, белки-антигены могут быть получены методами генной инженерии либо синтезированы химически методами пептидного синтеза.

Использование того или другого метода очистки или синтеза аутоантигена зависит прежде всего от его биохимической природы и определяется особенностями связывания с ним аутоантител. Рекомбинантные белки и синтетические пептиды более удобны в работе, так как методы их получения легко стандартизируются. Однако чем менее очищен антиген, тем больше он сохраняет свою третичную структуру, таким образом, взаимодействие аутоантитела более приближено к условиям взаимодействия "in vivo".

Хотя большинство белков, которые используются в коммерческих наборах для выявления АНА, являются рекомбинантными и уже не экстрагируются из ядер клеток, конкретные разновидности белковых антигенов АНА продолжают называть общим термином "экстрагируемый нуклеарный антиген" (ЭНА) — extractible nuclear antigen (ЕNА). Нуклеиновые кислоты водонерастворимы и поэтому, формально, они не входят в состав ЭНА.

Выявление антител к ЭНА представляет собой самостоятельный показатель, обычно определяемый с помощью метода ИФА. Его использование, наряду с определением АНФ, позволяет уточнить присутствие в исследуемой сыворотке антител к хорошо растворимым конформационным антигенам, прежде всего к SS-А, которые могут утрачиваться в ходе фиксации клеток перевиваемых клеточных линий.

Будучи открытыми на стыке клинической иммунологии и молекулярной биологии, аутоантитела против внутриклеточных антигенов способствовали изучению функционирования клеточных структур. Описание антинуклеарных антител активно продолжается в настоящее время одновременно с совершенствованием лабораторных технологий и углублением фундаментальных познаний о строении клетки.

Большинство видов АНА направлены к сложным комплексам рибонуклеиновых кислот и белков. Изучение антинуклеарных антител зачастую опережало открытие функциональных белков и рибопротеиновых комплексов, что привело к возникновению двойной номенклатуры при описании некоторых видов АНА, включающей как общепринятое название аутоантитела, так и указание конкретного ядерного белка. Обычно типу антинуклеарных антител присваивали название в соответствии с именем пациента, у которого эта разновидность АНА была впервые обнаружена. В основе более современной номенклатуры лежат клеточные мишени аутоантител, с которыми они взаимодействуют.

Так, антитела к антигену Rо/SS-А (Rо по фамилии больного Robair/SS-А—Sjogren's) направлены на белки массой 52 и 60 кДа, связанные с Y1-Y5 РНК в составе сплайсосомы, а антитела к антигену Lа/SS-В (по больному Lapiere/ Sjogren's syndrome B antigen) направлены на белок, связанный с РНК-полимеразой III. Номенклатура аутоантител, основанная на фамилии пациента, постепенно уходит в прошлое. Так, в современной литературе доминирует название антигенов с указанием молекулярной массы, например, SS-А антиген молекулярной массы 52 и 60 кДа.

Возможна ситуация, при которой указывается конкретная клеточная мишень аутоантител. Так, антитела, направленные на ядерный антиген пролиферирующих клеток, получили название по имени белка, с которым они реагируют, — РСNА1 (proliferating cell nuclear antigen 1).

Разновидность АНА может получить название в соответствии с молекулярной массой белка, с которым оно взаимодействует, например аутоантитела анти-р80 направлены на белок массой 80 кДа. Последующие исследования установили точную клеточную мишень, как, например, для анти-р80 антител это белок койлин. У больных со склеродермией были обнаружены антитела, направленные на антиген массой 70 кДа и получившие название Scl-70. Позднее было установлено, что мишенью Scl-70 антител является топоизомераза 1, точнее, ее иммунодоминантный эпитоп, получивший название ТОРО-1.

Может сложиться ситуация, при которой в одной сыворотке будут одновременно обнаружены антитела разных специфичностей, направленные к нескольким антинуклеарным антигенам. Некоторые антитела часто выявляются сочетанно — например, антитела к SS-А и SS-В либо антитела к U1-RNР и Sm антигенам. Эти ассоциации обусловлены тем, что антигены входят в состав единого белкового комплекса, с которым реагируют аутоантитела. Некоторые разновидности АНА могут часто отмечаться сочетанно за счет того, что они встречаются при одном и том же заболевании или при перекрестных синдромах.

Антинуклеарный фактор и типы свечения ядра

Определение АНФ представляет собой основной тест для выявления антинуклеарных антител. Результатом определения АНФ является факт присутствия аутоантител в диагностическом титре, конечный титр разведения сыворотки, отражающий аффинность и концентрацию аутоантител, а также тип свечения ядра клетки.

Характеристики конкретной методики зависят, прежде всего, от выбора субстрата, который может варьировать от криосрезов (крысиных печени или почки) до культивируемых пролиферирующих клеточных линий, а также от метода фиксации ткани, который может влиять на сохранность ряда ядерных антигенов АНА.

В 1961 году Бек (Весk) впервые использовал криосрезы тканей крысы в качестве субстрата непрямой иммунофлюоресценции для обнаружения АНФ. Этот метод позволил получить полуколичественный результат, определяющий максимальный титр разведения сыворотки пациента, при котором сохраняется свечение ядер.

Это основной тест, который использовался в нашей стране для обнаружения АНА в клинике в течение многих лет, наряду с обнаружением LЕ-клеток. В последнее время его вытеснили методы обнаружения антител к ЭНА с помощью ИФА-метода. Основным недостатком использования этого метода является отсутствие в тканях лабораторных животных ряда антигенов человека, что несколько снижает чувствительность теста.

Уже в первом опыте клинического применения непрямой иммунофлюоресценции для выявления АНА с использованием криосрезов тканей лабораторных животных в качестве субстрата было отмечено, что сыворотка больных с аутоиммунными заболеваниями по-разному "окрашивала" ядра клеток, что приводило к селективному свечению некоторых структур ядра. Уточнение этого феномена привело к описанию так называемых "типов свечения" ядра в иммунофлюоресцентном тесте.

Это связано с тем, что каждая разновидность АНА имеет конкретные клеточные мишени, вследствие чего тип свечения ядра, ядрышка и цитоплазмы клетки отражает взаимодействие АНА сыворотки больного с антиген-содержащими структурами внутри клетки. Тип свечения зависит от присутствия конкретных аутоантител в сыворотке крови больного, на основе чего можно сделать предварительное заключение относительно тех разновидностей АНА, которые имеются в данной сыворотке. Однако применение гистологических срезов тканей лабораторных животных не позволяло достоверно установить тип свечения, что заставило искать более подходящий субстрат для решения этой задачи.

Последующая модификация метода выявления АНФ была создана Таном (Таn, 1982), применившим в качестве субстрата человеческую перевиваемую эпителиоидную клеточную линию НЕр-2. Это клеточная линия, полученная из аденокарциномы гортани человека, представляет собой крупные полиплоидные неороговевающие плоские эпителиоциты, образующие монослой на пластике и стекле. Крупные ядра и присутствие человеческих антигенов сделало метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 основным методом обнаружения АНФ.

В англоязычной литературе отсутствует единое название для этого метода, иногда этот метод для краткости обозначают как FАNА (Fluorescent AntiNuclear Antibody detection). Мы считаем возможным сохранить отечественное название этого показателя — "антинуклеарный фактор" (АНФ), чтобы отличать этот метод от других тестов для обнаружения АНА.

В качестве субстратов могут применяться и другие человеческие клеточные линии, однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования именно линия НЕр-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюоресценции. Ее применение улучшает чувствительность теста за счет яркой флюоресценции даже при значительных разведениях сыворотки больного, а большое, богатое эухроматином ядро позволяет точно описать тип свечения. Кроме того, применение клеточной линии НЕр-2 способствует обнаружению антител Rо/SS-А, а также антител к антигенам ядрышка, которые не выявляются при использовании ткани лабораторных животных. Среди других преимуществ НЕр-2 можно отметить высокую частоту деления клеток, позволяющую выявлять антитела к антигенам, экспрессирующимся только при делении клетки, и отсутствие клеточного матрикса ткани, затрудняющего визуализацию специфического свечения при сравнении с гистологическими срезами.

Нами было проведено сравнение выявляемости АНФ с использованием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 и серийных криосрезов печени крысы. Было обследовано 100 сывороток больных с ревматоидным артритом, при котором встречаемость АНФ составляет около 30%. Результаты показали, что при использовании клеточной линии НЕр-2 АНФ может быть обнаружен у 42% больных РА при сохранении абсолютной специфичности обследования. В то же время при использовании тканей крысы АНФ отмечался лишь в 26% случаев (табл. 10).

Таблица 10. Результаты сравнения выявления АНФ на перевиваемой клеточной линии НЕр-2 и криосрезах ткани печени крысы Печень крысы Монослой клеток НЕр-2 АНФ+ АНФ- Сумма АНФ+ 26% 0% 26% АНФ- 16% 58% 74% Сумма 42% 58% 100%

Таблица 11. Тип свечения при непрямой иммунофлюоресценции и наличие антинуклеарных антител Тип свечения Специфичность антитела Характеристика антигена Заболевание Гомогенный/ периферический дсДНК ДНК хроматина СКВ Ламины ядра Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4 лекарственная СКВ Гранулярный Sm Белки В', B, D, E, F, связанные с U1-U6 RNP Маркер СКВ RNP Белки А и С, связанные с U1-RNP СКВ, СЗСТ PCNA/Ga 36 кДа белок, связанный с ДНК-полимеразой дельта СКВ Мелкогранулярный Ro/SS-A 52, 60 кДа белок, связанный с Y1-Y5 RNA СШ, СКВ La/SS-B 48 кДа связан с РНК-полимеразой III СШ Scl-70 70 кДа антиген склеродермии CC PCNA Белок, ассоциированный с ДНК-полимеразой СКВ Центромерный Антицентромерный CENP A, B, C CREST Ядрышковый Крупногранулярный Фибриллярин CC Мелкогранулярный РНК-полимераза I CC Мелкогранулярный РМ-1 (PM/Scl) ПМ/ДМ, СС Ядрышковый, в зависимости от клеточного цикла Ku Белки ядерного матрикса 70 и 80 кДа СКВ Цитоплазматический ASM F-актин Аутоиммунный гепатит AMA Пируват декарбоксилазный комплекс Первичный билиарный цирроз анти Jo-1, PL-7, PL-12 etc тРНК-синтетазы ПМ/ДМ

Таким образом, использование клеточной линии НЕр-2 является в среднем на треть более чувствительным методом по сравнению с традиционно используемыми тканевыми субстратами.

При использовании тканей лабораторных животных диагностический титр АНФ составляет 1:8-1:10, тогда как при использовании клеточной линии НЕр-2 диагностическим является титр 1:40-1:80. При таких значениях диагностических титров частота слабоположительных результатов у клинически здоровых лиц составляет не более 5% и в то же время не позволяет пропустить значимые титры АНА у больных диффузными болезнями соединительной ткани. На фоне обострения ревматических заболеваний обычно отмечаются титры АНФ более 1:640, а при ремиссии титры снижаются до 1:160-1:320.

Существуют рекомендации по балльной оценке результатов выявления АНФ, указывающей содержание АНФ "в крестах". Это позволяет лабораториям экономить реактивы и уменьшить трудозатраты на выполнение исследований. Однако необходимо учитывать, что конечный титр имеет более важное значение по сравнению с количеством связавшихся с субстратом аутоантител, так как непосредственно связан с аффинностью их взаимодействия с антигеном.

Желательно определять конечный титр у всех положительных больных, что позволяет уточнять присутствие в сыворотке высокоаффинных аутоантител, которые более тесно связаны с активностью процесса. Необходимо выявлять АНФ класса IgС, так как выявление АНФ, представленного другими классами иммуноглобулинов, не имеет самостоятельного диагностического значения.

Тип свечения ядра клетки значительно увеличивает информативность выявления АНФ, в связи с чем должен рутинно определяться при постановке этого теста.

Использование клеток линии НЕр-2 позволяет охарактеризовать более 20 различных вариантов окрашивания ядра, которые зависят от спектра АНА, присутствующих в исследуемой сыворотке. Однако для практической лаборатории достаточно различать 6 основных вариантов свызывания аутоантител с антиген-содержащими структурами клетки.

Выделяют гомогенный, периферический, гранулярный (мелко-/крупно-), ядрышковый, центромерный и цитоплазматический типы свечения ядра (рис. 7).

Каждому типу свечения присущи очень характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого, а также набор антигенов, с которыми реагируют аутоантитела в сыворотке больного. Описание типов свечения представляет ценную клиническую информацию само по себе, кроме того, тип свечения может указывать на необходимость проведения определенных лабораторных тестов в дальнейшем (табл. 11).

При гомогенном типе свечения аутоантитела реагируют с теми антигенами, которые распределены в ядре диффузно, то есть входят в состав хроматина. При обнаружении гомогенного типа свечения в делящихся клетках ярко окрашиваются конденсированные хромосомы. Основными структурными единицами хроматина являются нуклеосомы — комплексы ДНК и гистонов. Таким образом, гомогенный тип свечения предполагает наличие антител против нуклеосом, дсДНК и антител к пистонам. Он встречается у больных с СКВ и лекарственной волчанкой, а также у больных со склеродермией. Обычно обнаружение высокого титра АНФ с гомогенным типом свечения указывает на диагноз СКВ.

Периферический тип свечения часто выделяют отдельно, хотя он является разновидностью гомогенного типа свечения. Его выявление является артефактом фиксации клеток, что приводит к перераспределению хроматина на периферию ядра. Важно отличать периферический тип свечения от окрашивания ядерной мембраны, которое отмечается при аутоиммунных заболеваниях печени. Периферический тип свечения обнаруживается при наличии антител к двуспиральной ДНК и выявляется преимущественно у больных с СКВ.

Гранулярный тип является наиболее часто встречающимся и, одновременно, наиболее неспецифическим. Иногда этот тип свечения в отечественной литературе называют "крапчатым" или "сетчатым". Название "гранулярный" более точно отражает данный феномен, так как в этом случае аутоантитела реагируют с гранулами в ядре, представляющими надмолекулярные нуклеопротеиновые комплексы. Такие комплексы белков и нуклеиновых кислот осуществляют в ядре ряд функций, необходимых для нормального функционирования клетки. К таким комплексам, в частности, относятся сплайсосомы, которые осуществляют посттранскрипционную перестройку мРНК, необходимую для синтеза белка на рибосомах. В их составе присутствует множество различных нуклеопротеинов, что обуславливает многообразие антигенных мишеней при обнаружении гранулярного типа свечения.

К основным аутоантигенам, антитела к которым приводят к визуализации гранулярного типа свечения, относят Sm, U1-RNР, SS-А, SS-В антигены и RCNA. Клетки в процессе деления утрачивают большинство сформированных нуклеопротеиновых комплексов, поэтому митотические фигуры в клеточной линии при гранулярном типе свечения не окрашиваются. Гранулярный тип свечения ядра отмечается у больных при СКВ, СШ, СС, ДМ/ПМ, РА и ряде других аутоиммунных заболеваний. Низкие титры АНФ с гранулярным типом преобладают в сыворотках крови у клинически здоровых лиц с АНФ без признаков системного заболевания.

Антигены ядрышка могут выступать в качестве мишеней АНА, что приводит к обнаружению ядрышкового типа флюоресценции. Выявление ядрышкового типа свечения характерно для склеродермии и ее разновидностей. Ядрышковый тип флюоресценции определяется у больных при наличии антител к компонентам ядрышка, таким как РНК-полимераза I, NOR, U3-RNР, РМ/Scl.

Центромерный тип флюоресценции отмечается при появлении антител к центромерам хромосом и обнаруживается только в делящихся клетках. Его присутствие характерно при CRESТ-варианте склеродермии.

Цитоплазматический тип свечения указывает на антитела к тРНК-синтетазам, в частности Jо-1, которые отмечаются при полимиозите. Кроме того, он выявляется у больных с АНА, направленными против других компонентов цитоплазмы клетки: антитела к актину при аутоиммунном гепатите, антитела к митохондриям при первичном билиарном циррозе.

Можно охарактеризовать ряд других разновидностей свечения, причем эти типы окрашивания ядра клеток могут быть характерны для конкретной разновидности AHA. Так, антитела к Scl-70 в иммунофлюоресцентном тесте на НЕр-2 клетках дают мелкогранулярное окрашивание ядра и ядрышек, анти-р80 — светящиеся точки в ядре, которые отсутствуют в митотических клетках. Однако необходимо указать на редкость и разнообразие таких феноменов, что делает излишним их выявление при рутинных исследованиях.

Нередко может встречаться сочетание нескольких типов свечения, например мелкогранулярного и ядрышкового, что характерно для антител к Scl-70. Более того, часто в низких разведениях преобладает один тип свечения, например гранулярный, а при дальнейших разведениях выявляется гомогенный или центромерный типы флюоресценции, что свидетельствует о наличии в сыворотке больного различных видов АНА.

Хотя тип свечения дает врачу определенные данные в пользу того или иного диагноза, необходимо принимать во внимание сравнительно низкую его специфичность и разнообразие встречающихся феноменов, что требует дальнейшего лабораторного обследования.

Обнаружение АНФ является основой для использования других лабораторных тестов, уточняющих спектр АНА в крови больных. Учитывая крайнюю информативность этого теста, дальнейшее тестирование и анализ результатов последующего обследования должен интерпретироваться в зависимости от результатов оценки типа свечения и титра АНФ.

При использовании тканей лабораторных животных, таких как почка или печень крысы, у 10% больных, удовлетворяющих критериям для диагноза СКВ, АНА не определяются или титры их очень низки. Этих больных условно относят к группе "АНФ-негативной СКВ", для уточнения диагноза у таких больных требуется дальнейшее обследование, прежде всего выявление антител к SS-А антигенам. Эти антигены обладают хорошей растворимостью и могут утрачиваться из ядер клеток.

Применение в качестве субстрата клеточной линии НЕр-2 значительно сокращает численность категории пациентов с АНФ-негативной СКВ, при его использовании она не превышает 5%. Необходимо учитывать, что при использовании традиционной метанол-ацетоновой фиксации клеточной линии SS-А антиген может диффундировать в цитоплазму клетки, в результате чего титры АНФ значительно снижаются.

Для устранения этих недостатков была создана трансгенная клеточная линия НЕр-2000, в генотип которой был искусственно внесен ген SS-А антигена. За счет этого в ее ядре отмечается гиперэкспрессия SS-А антигена, что несколько увеличивает чувствительность выявления АНА. Однако даже использование трансгенных клеточных линий не позволяет окончательно избавиться от проблемы "АНФ-негативной СКВ". Даже при максимально скрупулезном обследовании до 2-3% пациентов с клинически очевидной СКВ не имеют диагностических концентраций АНФ. Для сокращения этой категории пациентов используется комплексное тестирование, которое будет подробно описано при обсуждении алгоритмов обследования больных с системными заболеваниями.

  • Антитела к экстрагируемому нуклеарному антигену [показать]

    В состав ЭНА входит фракция растворимых ядерных белков, которые могут быть получены из ядра клетки. В его состав входит 6 основных рибонуклеопротеиновых антигенов АНА, таких как SS-А, SS-В, Sm, U1-RNP, Scl-70 и Jo-1, а также ряд других минорных антигенов.

    Использование ЭНА в методах, таких как двойная иммунодиффузия и контрэлектрофорез, может использоваться для скрининга этих специфичностей аутоантител. Эти скрининговые методы с использованием ЭНА низкочувствительны и при сопоставлении с АНФ выявляют только 50-60% положительных сывороток. Тем не менее, высокая специфичность методов позволяет использовать их в качестве методов сравнения по отношению к другим более чувствительным тестам.

    Обычно обнаружение антител к ЭНА используется совместно с АНФ для того, чтобы не пропустить случаи "АНФ-негативной СКВ". Необходимо отметить ИФA тест-системы, позволяющие проводить скрининговое обследование для обнаружения антител к ЭНА у ревматологических больных. Отличие тест-систем для скрининга состоит в том, что в инкубационную лунку помещается смесь антигенов, и положительный результат теста указывает на наличие у больного одной или одновременно нескольких разновидностей АНА.

    Учитывая большую чувствительность метода ИФА в целом, его применение более оправданно для скрининга АНА, однако необходимо помнить о большой частоте неспецифических реакций при его применении.

    Существуют две основные разновидности ИФА для скринингового обнаружения антител к ЭНА. В одном случае в лунку наносится тотальный ядерный экстракт, а в другом — смесь рекомбинантных очищенных белков, представляющая основные разновидности рибонуклеопротеиновых антигенов. Использование смеси рекомбинантных белков делает обследование более специфичным и улучшает стандартизацию выявления аутоантител. В то же время далеко не все антигены АНА могут быть нанесены на ИФА-планшет, в результате чего комбинированные тесты пропускают до 40% положительных результатов.

  • Антитела к дсДНК [показать]

    При СКВ антитела к дсДНК могут быть обнаружены у 40-50% больных и характеризуются гомогенным типом свечения ядра НЕр-2 клеток при выявлении АНФ. Причиной их появления является сенсибилизация к компонентам ядерного материала, высвобождающегося из ядер клеток в ходе апоптоза. Антитела к дсДНК включены в состав 10 критериев СКВ Американской Ассоциации Ревматологов (в настоящем Американского Колледжа Ревматизма), совместно с обнаружением антител к Sm антигену, LЕ-клеток и антител к кардиолипину (ложнопозитивной реакции Вассермана) (табл. 12).

    Таблица 12. Пересмотренные критерии СКВ 1982 года Американского Колледжа Ревматизма (Arthritis Rheum, 1982; 25:1271-1277)
    1. Симптом волчаночной бабочки
    2. Дискоидные поражения кожи
    3. Фоточувствительность
    4. Безболезненные изъязвления во рту или носоглотке
    5. Неэрозивный артрит 2 и более суставов
    6. Серозит (плеврит/перикардит)
    7. Поражение почек (протеинурия >0,5 г/л или цилиндрурия)
    8. Поражения ЦНС (судороги или психоз)
    9. Гематологические проявления (гемолитическая анемия с ретикулоцитозом, лейко-/лимфо-/тромбоцитопения)
    10. Результаты иммунологических исследований (LЕ-клетки, анти-дсДНК, анти-Sm, ложноположительная реакция Вассермана)
    11. Антинуклеарные антитела
    Предложенная классификация основывается на 11 критериях, для постановки диагноза СКВ требуется наличие (одновременно либо последовательно) 4 из перечисленных 11 критериев.

    Cпектр иммунологических исследований с 1982 года значительно изменился — в кaчестве специфических иммунологических тестов при СКВ можно рекомендовать обнаружение антител к дсДНК, антител к Sm антигену, изолированное обнаружение антител к SS-А 60 кДа, aнтител к рибосомальному белку Р, антител к антигену пролиферирующих клеток (RCNA), антикардиолииновых антител классов IgG и IgМ, волчаночный антикоагулянт и антитела к бета2-ГП I

    Выявление антител к дсДНК способно предсказать развитие СКВ до проявления развернутой картины заболевания. Так, при проспективном наблюдении СКВ развивается в течение одного года после обнаружения антител к дсДНК в Фарр-тесте у 70% пациентов, и только 15% пациентов остаются здоровыми через 5 лет после получения положительного результата Фарр-теста.

    Антитела к дсДНК направлены на фосфодиэфирный скелет молекулы и связывание антител не зависит от ее конформации и нуклеотидной последовательности. Взаимодействие между паратопом антитела и ДНК основано на электростатических связях, которые чрезвычайно чувствительны к рН и концентрации солей в растворе. Для обнаружения данных антител используется ряд методов (см. выше), однако нередки противоречивые результаты обследования. В качестве скринингового теста для выявления антител к дсДНК может быть рекомендовано применение реакции непрямой иммунофлюоресценции на Crithidia luciliae (CL-ИФТ).

    Этот метод обладает высокой специфичностью, однако его чувствительность низка. Метод ИФА очень чувствителен, однако весьма неспецифичен и выявляет низкоаффинные антитела к ДНК, характерные для многих инфекционных и воспалительных заболеваний. Большая часть исследований, указывающих на роль концентраций антител к дсДНК в мониторинге активности заболевания, выполнено с помощью радиоиммунного теста Фарр, и не всегда эти результаты могут быть полностью подтверждены при использовании других тестов.

    Антитела к дсДНК участвуют в патогенезе развития волчаночных васкулитов и люпус-нефрита. Титры антител к дсДНК тесно коррелируют с концентрацией IgG-содержащих ЦИК в сыворотке крови больных СКВ. Исследования элюатов из почечных клубочков больных, умерших от СКВ, указывают на большую концентрацию антител к дсДНК в элюате по сравнению с их концентрацией в сыворотке. Это позволило заподозрить значение иммунных комплексов, содержащих антитела к дсДНК, в патогенезе поражения почек при СКВ.

    Обнаружение способности двухспиральной ДНК связываться с базальной мембраной клубочка, способствовало укреплению теории об иммунокомплексном поражении почки при СКВ, приводящего к образованию иммунных комплексов в клубочке in situ, активации комплемента с потреблением его сывороточных резервов и развитию воспалительных инфильтратов.

    У большинства больных с активными почечными формами СКВ отмечаются антитела к дсДНК. Для определения риска поражения почек рекомендуется обследование всех больных СКВ для выявления антител к дсДНК и гипокомплементемии. Имеется прямая корреляция между нарастанием титра антител к дсДНК, выраженностью гипокомплементемии и тяжестью волчаночного нефрита. Аффинность антител к дсДНК в сыворотке представляет собой постоянно меняющуюся величину.

    Так, непосредственно при обострении гломерулонефрита содержание высокоаффинных антител в сыворотке больного весьма незначительно, однако в элюатах из почечных клубочков содержание высокоаффинных антител очень высоко. Во время ремиссии титры высокоаффинных антител к дсДНК постепенно возрастают, и их сывороточные уровни максимальны непосредственно перед вспышкой гломерулонефрита. В то же время у пациентов с СКВ с высоким содержанием низкоаффинных антител в методе ИФА чаще отмечается поражение центральной нервной системы.

    Особая роль в ведении больных СКВ отводится мониторингу концентрации антител к дсДНК для профилактики обострений. При этом динамике концентрации антител к дсДНК придается большее прогностическое значение даже по сравнению с их абсолютным содержанием. Нарастание титра антител к дсДНК (удвоение титра в течение 3 месяцев) и гипокомплементемия предшествуют развитию гематурии и протеинурии в 90% наблюдений. Биопсия почки у таких больных почти всегда выявляет наличие значительных иммунноопосредованных изменений, даже при отсутствии клинических проявлений обострения.

    Увеличение титра анти-дсДНК антител в течение нескольких недель является предвестником вспышки СКВ, что может быть установлено при ежемесячном мониторинге их концентрации в сыворотке крови. Раннее распознавание этих состояний наряду с активной стероидной/иммуносупрессивной терапией играет значимую роль в снижении смертности и инвалидизации у больных с поражением почек при СКВ. Рекомендуется профилактическая терапия больных с нарастанием титра антител к дсДНК вплоть до его снижения и восстановления нормальных концентраций факторов комплемента в сыворотке крови больных.

    Исследования, выполненные для оценки значимости мониторинга концентраций антител к дсДНК, указывают на то, что активная профилактическая терапия при повышении титра антител к дсДНК, при условии динамического ежемесячного контроля, снижает количество обострений при СКВ, что ведет к улучшению прогноза у этих больных.

  • Антитела к осДНК [показать]

    Антитела к осДНК встречаются при СКВ даже чаще, чем антитела к дсДНК, и могут быть обнаружены приблизительно у 70% больных с СКВ. Хотя они неспецифичны для СКВ, их обнаружение в элюатах больных СКВ, умерших от гломерулонефрита, может свидетельствовать о роли антител к осДНК в патогенезе поражения почек при волчаночном нефрите.

    При других заболеваниях соединительной ткани они выявляются с похожей частотой, кроме того, антитела к односпиральной ДНК могут быть обнаружены при множестве других патологических состояний, массивной травме, инфекциях и у клинически здоровых людей. Высока встречаемость антител к осДНК у онкологических пациентов, получающих цитотоксическую терапию. Неспецифичность обнаружения этих аутоантител в значительной степени ограничивает их применение в клинике.

    Обнаружение в сыворотке больного антител к осДНК класса IgМ имеет значение для диагностики дискоидной красной волчанки. При кожной форме волчанки, сопровождающейся появлением антител к осДНК, по сравнению с кожной формой волчанки без этих антител, отмечается высокая частота развития системного заболевания в виде генерализованной формы СКВ.

    Приблизительно 20% больных с кожной формой волчанки, негативных по АНФ при непрямой иммунофлюоресценции, имеют значительный титр антител к осДНК класса IgМ. Такие пациенты носятся к группе "АНА негативной красной волчанки" и требуют дальнейшего лабораторного обследования.

  • Антитела к гистонам [показать]

    Эти антитела реагируют с протеиновыми составляющими нуклеосом — ДНК-протеиновых комплексов, формирующих структуры транскрипционно неактивного хроматина. Как и антитела к ДНК, антитела к гистонам реагируют с хроматином, диффузно распределенным в ядре клетки, что приводит к гомогенному типу свечения ядра при использовании клеток линии НЕр-2.

    Каждая нуклеосома состоит приблизительно из 140 пар оснований ДНК, обернутой вокруг ядра из белков-гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, а Н1 покрывает ДНК в промежутках между нуклеосомами.

    У 70% больных СКВ аутоантитела направлены на гистоны Н1 и Н2В, в то время как АНА к другим типам гистонов наблюдаются значительно реже. Высокие титры антител к гистонам характерны для лекарственной волчанки, хотя эта зависимость не абсолютная. Они могут быть обнаружены совместно с антителами к осДНК и использованы в целях ее диагностики, однако выявление антител к гистонам не входит в число распространенных лабораторных тестов.

    Лекарственно-индуцированная волчанка является результатом побочного действия фармацевтических препаратов. Список препаратов, при которых была описана лекарственная волчанка, достаточно широк. Наиболее часто синдром лекарственной волчанки отмечается на фоне фенитоина, хинидина, гидралазина, метилдопы, прокаинамида, хлорпромазина и изониазида.

    Синдром характеризуется развитием люпоидноподобного заболевания с лихорадкой и полисерозитом. Лекарственно-индуцированная волчанка, как правило, протекает без поражения почек. С другой стороны, при лекарственно-индуцированной волчанке наблюдается нормальное содержание факторов комплемента в плазме крови и полное отсутствие других классических иммунологических маркеров СКВ, как-то: антител к дсДНК, Sm. Лишь при приеме D-пенициллинамина описано развитие гломерулонефрита, поражение кожи с появлением антител к дсДНК.

    У больных лекарственной СКВ выявляются очень высокие титры АНА, и почти у всех пациентов имеются антитела к гистонам. Антитела к гистонам могут быть обнаружены при использовании иммуноферментного анализа или иммуноблоттинга, но рутинные методы, такие как иммунодиффузия и контрэлектрофорез с использованием клеточных экстрактов, включающих гистоны, также достаточно информативны.

    Отмена лекарственного препарата приводит к постепенному снижению титров аутоантител и их исчезновению из сыворотки крови в течение 6 месяцев. Это позволяет рекомендовать при дифференциальной диагностике лекарственной СКВ исследование парных титров АНФ в течение полугода после отмены препарата. Необходимо учитывать, что проявление васкулита при лекарственных реакциях также может быть обусловлено индукцией АНЦА.

    Антитела к гистонам в высоком титре иногда отмечаются у больных со склеродермией, а также у пациентов с аутоиммунным гепатитом. В низком титре возможно их обнаружение при ревматоидном и юношеском артритах, первичном билиарном циррозе, инфекции вирусом Эпштейна-Барр, шизофрении, сенсорных нейропатиях, моноклональных гаммапатиях и злокачественных новообразованиях, а также они часто отмечаются у пожилых лиц. Клинических особенностей у больных с этой разновидностью АНА не обнаружено.

  • Антитела к нуклеосомам [показать]

    Нуклеосомы представляют собой универсальные структуры хроматина и являются основной формой хранения эукариотической ДНК. Значительное содержание циркулирующих нуклеосом обнаруживается у больных с онкологическими заболеваниями при цитостатической терапии, при септических состояниях, а также у больных СКВ. Предполагается, что в основе этого явления лежит индукция клеточного апоптоза.

    При СКВ установлен факт избыточного апоптоза ряда клеток, в частности лимфоцитов периферической крови, эндотелиальных клеток и кератиноцитов, но до сих пор не выяснено, какую роль играет этот процесс в патогенезе СКВ. При апоптозе эндонуклеазы разрывают ДНК в промежутках между нуклеосомами и последние поступают в кровоток. Свободная дсДНК обнаруживается в периферической крови только в составе нуклеосом.

    В настоящее время нуклеосомы рассматриваются в качестве основного иммуногена, стимулирующего иммунный ответ Т- и В-клеток при СКВ. Из пула лимфоцитов периферической крови больных можно выделить СD4+ клоны Т-клеток, специфичные к нуклеосомальным антигенам.

    Установлен ряд иммунодоминантных пептидов в составе гистонов, индуцирующих пролиферативные ответы и секрецию цитокинов в культурах лимофоцитов из крови больных СКВ. При контакте антигенспецифичных СD4+ лимфоцитов с В-клетками в культуре in vitro наблюдается продукция специфических антинуклеосомальных антител и антител к дсДНК.

    Антигены некоторых вирусов способны ассоциироваться с нуклеосомами с образованием иммуногенных комплексов, которые могут индуцировать бласттрансформацию в культуре лимфоцитов периферической крови больных СКВ.

    Иммунизация нуклеосомами лабораторных животных приводит к образованию АНА, антител к ДНК, антифосфолипидных антител и ряда морфологических признаков волчаночного нефрита.

    Антитела к нуклеосомам стали изучаться в качестве маркера СКВ сравнительно недавно. Установлено, что антитела к нуклеосомам отмечаются у 70% больных СКВ. Сравнительно редко они обнаруживаются у больных с СШ (5-8%) и с той же частотой при СЗСТ. Этот тип АНА не выявляется у больных другими заболеваниями соединительной ткани и здоровых доноров, что позволяет отнести антинуклеосомные антитела в разряд высокоспецифических маркеров СКВ.

    Высокие титры антинуклеосомных антител характерны исключительно для больных с активной СКВ, сопровождающейся нефритом, и их уровень положительно коррелирует с показателями активности заболевания. При мониторинге их содержания было установлено, что титры антител к нуклеосомам увеличиваются непосредственно перед вспышкой заболевания параллельно с развитием гломерулонефрита.

    Нуклеосомы, находящиеся в крови, обладают высокой аффинностью к гепарансульфату базальной мембраны клубочков и способны откладываться на ней, приводя к связыванию антинуклеосомальных антител и антител к дсДНК, с последующим развитием гломерулонефрита. Содержание антинуклеосомных антител обратно коррелирует с уровнем циркулирующих нуклеосом в крови больных СКВ.

  • Антитела к рибонуклеопротеинам [показать]

    Антитела к рибонуклеопротеинам представляют собой подсемейство АНА, включающее анти-Sm, анти-snRNР (U1-RNР), анти-Rо/SS-А, анти-Lа/SS-В. При СКВ эти разновидности АНА суммарно встречаются чаще, чем антитела к дсДНК. Антитела к SS-А и SS-В антигенам были первыми описанными разновидностями АНА (Anderson, 1960). Эти аутоантитела реагируют с комплексами полипептидов и рНК.

    Для всех АНА к рибонуклеопротеинам характерен гранулярный тип свечения АНФ на клетках линии НЕр-2. Все эти белки входят в состав сплайсосом — надмолекулярных комплексов, осуществляющих перестройку мРНК.

    Концентрация антител к рибонуклеопротеинам в сыворотке больных ДБСТ необычайно высока. Так, например, в одном из исследований было показано, что приблизительно 20% всей гамма-глобулиновой фракции у больных с СКВ направлено против U1-RNР антигена.

    Если антитела к дсДНК выявляются высокочувствительными методами, такими как иммунофлюоресценция, радиоиммунопреципитация и иммуноферментный анализ, то антитела к рибонуклеопротеинам определяются специфичными, но нечувствительными методами иммунодиффузии и контрэлектрофореза.

    В сыворотке больных антитела к рибонуклеопротеинам могут присутствовать как изолированно, так и наряду с антителами к дсДНК. Клиническое значение антител к рибонуклеопротеинам сложно переоценить, в связи с их прогностическим значением. Так, они определяют группу больных СКВ, у которых ведущим клиническим проявлением является поражение кожи. Хотя поражение почек у этих больных не исключено, частота волчаночного гломерулонефрита у них гораздо ниже, чем при анти-дсДНК позитивной волчанке. Обнаружение рибонуклеопротеиновых АНА при синдроме Шогрена указывает на вероятность экстрагландулярных проявлений заболевания, а обнаружение U1-RNР позволяет отнести пациентов в группу смешанного заболевания соединительной ткани.

  • Антитела к Sm антигену [показать]

    В 1966 году Таn и Кunkеl описали систему Sm антигенов (антиген Смит), реагирующих с антителами из сыворотки больной с фамилией Smith. В настоящее время установлено, что Sm антиген образуют около 9 белков, составляющих ядро snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) — рибопротеиновых комплексов, включающих молекулы малой ядерной РНК (snRNА) и десятка ассоциированных белков. Ядро комплекса, в которое входит Sm антиген, покрыто белками U1-RNР антигена.

    Антитела к белкам Sm антигена (В/В', D) встречаются изолированно, в то время как антитела к белкам U1-RNР (70 кДа, А, С) могут встречаться совместно с антителами к Sm, и для антител к Sm, и к U1-RNР характерно обнаружение гранулярного типа свечения АНФ, которое требует определения конкретных мишеней АНА с помощью уточняющих тестов.

    Антитела к Sm антигену представляют высокоспецифичный, но сравнительно редко встречающийся маркер СКВ. Антитела к Sm антигену отмечаются приблизительно у 20-30% больных СКВ. Имеются указания на их низкую встречаемость в европейской популяции, не превышающей 20%.

    Антитела к Sm встречаются 6 основном у представителей африканской и азиатской рас — у 30-40% пациентов, важность выявления антител к Sm антигену при СКВ обусловлена их абсолютной специфичностью при этом заболевании, что явилось причиной включения этой разновидности АНА, наряду с антителами к дсДНК и LЕ клетками, в один из классификационных критериев СКВ Американской Ассоциации Ревматологов (табл. 12).

    Клиническими признаками, связанными с наличием Sm антител, являются, прежде всего, более агрессивное течение заболевания, поражение центральной нервной системы, волчаночные психозы и относительная сохранность функции почек.

    Вопрос о необходимости мониторинга для прогнозирования обострения заболевания окончательно не решен, но, в связи с низкой встречаемостью антител к Sm практически не выполняется.

  • Антитела к RNР (U1-RNР) [показать]

    Антитела к U1-RNР направлены против белков А, С и белка 70 кДа, входящих в состав рибонуклеопротеина, содержащего U1 малую ядерную РНК. Антитела к snRNР встречаются приблизительно у 30% больных с СКВ (табл. 13), причем при СКВ они обычно отмечаются совместно с антителами к Sm антигену.

    Таблица 13. Диагностическое значение антител к snRNР (U1-RNР) Популяции больных Комментарий СЗСТ Сочетание миозита, склеродермии и волчанки СКВ Часто синдром Рейно, реже поражение почек Синдром врожденной красной волчанки (AV-блокада) Ребенок от snRNР-позитивной матери Склеродермия Окoло 5% больных snRNР-позитивны Полимиозит Около 10% больных snRNР-позитивны

    Изолированное обнаружение высоких титров этих антител характерно для гетерогенной группы больных с признаками прогрессивного СС, СКВ и дерматомиозита. Это заболевание носит название "Смешанное заболевание соединительной ткани (mixed connective tissue disease)" или "Синдром Шарпа" (Sharp, 1972).

    Клиническая картина при СЗСТ представлена разнообразными признаками склеродермии, включая синдром Рейно, склеродактилию, нарушения моторики пищевода и фиброзирующее поражение легких, миозит, недеформирующий артрит и полисерозит. СЗСТ характеризуется редкостью поражения ЦНС и сохранностью функции почек, хорошим ответом на низкие дозы глюкокортикоидов и, в целом, благоприятным прогнозом. СЗСТ представляет собой частный случай так называемых перекрестных синдромов, сочетающих клиническую картину различных заболеваний соединительной ткани.

    Существует несколько наборов диагностических критериев СЗСТ, основным из которых является обнаружение антител к snRNР в сыворотке крови. Большинство исследователей склоняется к тому, что клинические признаки больных с антителами к snRNР удовлетворяют классификационным критериям СКВ, однако у них наблюдаются своеобразные клинические формы ее течения.

    Характерно, что у 30-50% больных СЗСТ отмечается позитивный тест волчаночной полоски (ТВП) при иммунoфлюоресцентном обследовании биопсий кожи. Этот тест высокоспецифичен для СКВ, что лишний раз подчеркивает родство СЗСТ и классической СКВ.

    У больных СКВ с антителами к snRNР обычно присутствуют синдром Рейно, признаки миозита и склеродактилия. Приблизительно у 5-10% больных с классическими признаками прогрессивного СС и у некоторых больных с полимиозитом также присутствуют антитела к snRNР. У snRNР позитивных матерей наблюдается высокий риск рождения ребенка с кожными признаками врожденного люпоидного синдрома и врожденной АV-блокады сердца. Поражение почек также может встречаться у больных СКВ с антителами к snRNР, хотя ее встречаемость значительно ниже, чем частота поражения почек, у больных с антителами к дсДНК.

    По всей видимости, СЗСТ представляет определенный этап в развитии заболевания, после чего оно трансформируется в определенную клиническую форму. Антитела к snRNР могут встречаться у больных с клиникой диффузной склеродермии или полимиозита. Так, при воспалительных миопатиях антитела к snRNР могут быть обнаружены приблизительно у 10% больных. У этих пациентов заболевание может начаться с субфебрилитета, артрита и синдрома Рейно, в дальнейшем наблюдается постепенная его прогрессия с развитием полимиозита. Сходная картина наблюдается у больных ПМ при наличии антител Rо/SS-А, что сопровождается клиникой полимиозита, несущего черты СКВ и синдрома Шогрена.

    В свою очередь у больных с диагнозом СЗСТ отмечаются антитела к осДНК, гистонам и антикардиолипиновые антитела с частотой, соответствующей СКВ. РФ встречается приблизительно у 30% этих пациентов.

    Тесты, направленные на обнаружение антител к snRNР, должны проводиться у всех больных, позитивных в иммунофлюоресцентном тесте, особенно с крупно-гранулярным типом свечения. Так как нет данных, свидетельствующих об изменении их концентрации при обострении заболевания, определение антител к snRNР в динамике не имеет определенного клинического значения. Совместно с антителами к snRNР в 50% случаев выявляются ревматоидный фактор и реже антитела к другим рибонуклеопротеинам, таким как Sm, SS-А и SS-В, а также антитела к дсДНК и к центромерам хромосом. Антитела к snRNР могут редко встречаться при некоторых других заболеваниях, например у больных с криптогенным фиброзирующим альвеолитом (синдромом Хаммона-Рича).

    Особый интерес представляет тот факт, что антитела к U1-RNР способны проникать внутрь живых клеток и связываться с внутриклеточными мишенями in vivo. При использовании проточной цитометрии было показано, что антитела к U1-RNР способны проникнуть в ядра половины живых клеток периферической крови. Кроме того, было показaно, что этот процесс не является обычным захватом сывороточного IgG и зависит от сохранности Fс-фрагмента молекулы иммуноглобулина. Аутоантитела могут проникать внутрь клетки благодаря нарушению проницаемости клеточной мембраны, либо в результате микропицоцитоза иммуноглобулинов, связавшихся с антигенами, экспонированными на поверхности клетки. В любом случае, этот, еще не изученный механизм проникновения антител в живые клетки, доказанный также в отношении антител к топоизомеразе 1 при склеродермии, по-видимому, играет определенную роль в иммунопатогенезе ДБСТ.

  • Антитела к Rо/SS-А [показать]

    В 1958 году Джонс (Jones) описал сывороточный фактор у больных с СШ, связывающийся с экстрактами слюнных и слезных желез. В 1961 году Андерсон (Anderson) обнаружил две разновидности аутоантител в крови больных с СШ, названные SjT и SjD. Позднее (Alspaug и Таn, 1975) они были окончательно идентифицированы под названиями Rо и Lа, в соответствии с именами больных, у которых они были впервые выделены.

    Согласно современной номенклатуре эти разновидности антител получили названия SS-А и SS-В (Sjogren syndrome A and B antigens). Антитела Rо/SS-А направлены против ядерных рибонуклеопротеинов с молекулярной массой 60 и 52 кДа, с которым связаны Y1-Y5 цитоплазматические РНК, транскрибируемые РНК-полимеразой III. Антиген SS-А присутствует в большинстве клеток человеческого организма, однако наибольших количествах его можно обнаружить в лимфоидных тканях, таких как тимус и селезенка.

    Антитела к Rо/SS-А могут быть выявлены всеми стандартными тестами для обнаружения АНА. Если субстратом для определения АНФ служат криосрезы печени или почек крыс, то большинство больных с антителами к Rо/SS-А будут негативны при непрямой иммунофлюоресценции, что входит в понятие "АНФ негативная СКВ".

    Антитела к Rо/SSА отмечаются приблизительно у 50% больных с СКВ, 70% больных ДКВ, у 60% больных с синдромом Шогрена, 30-40% больных с РА. Диагностически значимые титры этих антител могут встречаться у 1% здоровых женщин в возрасте 20-45 лет. Антитела к антигену массой 60 кДа сравнительно чаще выявляются у больных СКВ, тогда как при СШ отмечаются антитела против обоих антигенов, с массами 60 и 52 кДа.

    Антитела к Rо/SS-А обычно встречаются в популяции больных СКВ с выраженной симптоматикой фотосенситивных кожных проявлений, близких ДКВ, что обуславливает целесообразность активного поиска антител к Rо/SS-А при обследовании больных с предполагаемой СКВ с выраженными проявлениями фоточувствительности (табл. 14).

    Таблица 14. Клинические формы СКВ, сопровождающиеся антителами к Rо/SS-А массой 60 кДа Клиническая форма Комментарий АНА негативная волчанка При прицельном обследовании 75% этих больных имеют антитела к Rо/SS-А Подострая кожная волчанка Характерна выраженная фоточувствительность. До 70% больных Ro/SS-А позитивны, нередко отмечается симптоматика синдрома Шогрена Волчаноподобный синдром, связанный с недостаточностью факторов комплемента С2 или С4 50-75% больных Rо/SS-А позитивны, часто фоточувствительные поражения кожи, низкая частота антител к дсДНК СКВ с поздним началом Начало волчанки в возрасте 55 лет, почти 90% больных Rо/SS-А позитивны. Характерны кожные, нейропсихические и легочные проявления СКВ СКВ с синдромом Шогрена Клинические признаки СКВ и синдрома Шогрена, низкая частота поражения почек, часто выраженная фоточувствительность и кожные высыпания Врожденная красная волчанка Антитела к Rо/SS-А отмечаются у 100% матерей Миозит У 5% больных с полимиозитом отмечаются антитела к Rо/SS-А

    Часто такие больные описывают ожоги "сквозь оконное стекло", что свидетельствует о фоточувствительности к низкоэнергетическому длинноволновому ультрафиолетовому излучению. Клинические проявления при классической СКВ, сопровождающейся присутствием антител к Rо/SS-А, включают в себя симптомы фоточувствительности, вторичный СШ (у 10% больных), поражение легких, лимфопению, реже нефрит, тромбоцитопению и наличие ревматоидного фактора. Отмечается, что антитела к Rо/SS-А наблюдаются при сравнительно позднем начале развития СКВ (в возрасте после 50 лет) и протекающей со вторичным СШ. Эта разновидность заболевания характеризуется поражением легких, нейропсихическими проявлениями и реакциями фоточувствительности, на фоне нормальной функции почек.

    При классической ДКВ антитела к Rо/SS-А отмечаются в 75% наблюдений. У таких пациентов поражения кожи располагаются преимущественно в местах, подвергшихся действию инсоляциии. Они представляют собой небольшие эритематозные папулы или бляшки при эритематозно-папулезной форме, либо замкнутые циркулярные эритематозные высыпания при аннулярной полициклической форме, в иностранной литературе получившие название "подострая кожная красная волчанка". У больных ДКВ отмечается мышечно-суставной синдром, проявляющийся артралгиями либо артритом.

    Антитела к Rо/SS-А обнаруживаются у 98% матерей, у которых дети страдают синдромом врожденной волчанки. В основе этого заболевания лежит проникновение в кровь новорожденного через плаценту антител к Rо/SS-А. Основным проявлением врожденной волчанки является дерматоз, напоминающий ДКВ, и множество системных и гематологических синдромов, включающих врожденную поперечную АV-блокаду, гепатит, гемолитическую анемию и тромбоцитопению. Среди клинических манифестаций врожденная атриовентрикулярная блокада представляет собой самое тяжелое и необратимое осложнение и требует постановки искусственного водителя ритма непосредственно после рождения ребенка. Другие внесердечные проявления носят транзиторный характер и разрешаются после 6 месяцев, что соответствует времени истощения пула материнского IgG в крови ребенка. В эксперименте человеческий иммуноглобулин, содержащий антитела SS-А/Rо, обладает прямым кардиотоксичным действием в животных моделях ех vivo.

    Около половины матерей детей с врожденной волчанкой обычно асимптомны во время рождения ребенка или лишь изредка имеют проявления синдрома Шогрена, СКВ или СЗСТ. После рождения детей у большинства асимптомных матерей через некоторое время разворачивается картина того или иного заболевания соединительной ткани. Таким образом, все беременные с подозрением на системное заболевание соединительной ткани должны быть лабораторно обследованы для выявления группы риска врожденной красной волчанки. Установлено, что у больных с синдромом Шогрена, имеющих антитела к Rо/SS-А, больных с поздним началом СКВ, сопровождающимся наличием Rо/SS-А антител и признаками вторичного СШ, а также у больных с подострой кожной волчанкой отмечается повышенная частота определенных аллельных форм генов основого комплекса гистосовместимости, в частности НLА-В8, DR3, DQ1/2, что может указывать на общность генеза этих заболеваний.

  • Антитела к Lа/SS-В [показать]

    Антитела к SS-В антигену встречаются приблизительно у 10-15% больных с СКВ и около 50% больных с синдромом Шогрена. Антитела к Lа/SS-В направлены на белки массой 48 и 43 кДа, связанные с транскриптами РНК-полимеразы III.

    Lа/SS-В макромолекула связывает Rо/SSА-ассоциированные Y1-5 РНК, то есть в ряде случаев Lа/SS-В и Rо/SS-А представляют собой один антиген. Для антитела к Lа/SS-В характерен крупногранулярный тип флюоресценции АНФ на линии НЕр-2.

    Антитела к Lа/SS-В в подавляющем большинстве случаев наблюдаются совместно с антителами к Rо/SS-А, в то время как последние могут встречаться изолированно. Совместное обнаружение этих видов АНА является основой лабораторной диагностики СШ и обладает высокой специфичностью при данном заболевании.

    Синдром Шогрена является ревматическим заболеванием, поражающим слюнные и слезные железы и приводящим к ксеростомии и ксерофтальмии. Его встречаемость у лиц 50-70-летнего возраста достигает 5% всей популяции, причем преимущественно у женщин. Часто СШ сопровождается экстрагландулярными проявлениями, такими как васкулиты, и нередко на его фоне отмечается развитие лимфом.

    Первичный синдром Шогрена встречается изолированно, но признаки СШ могут обнаруживаться при РА, СКВ и других аутоиммунных заболеваниях в виде сочетания ксеростомии и ксерофтальмии. Так, по некоторым данным, до 20% больных с РА и СС отмечают проявления вторичного СШ.

    Предполагается, что антигены Rо/SS-А и Lа/SS-В концентрируются на поверхности клеток эпителия конъюнктивы и слюнных желез у больных с СШ. Сходное перераспределение этих антигенов отмечается в клетках перевиваемых линий, пораженных ретровирусами, что позволяет с определенной уверенностью предполагать вирусную этиологию этого заболевания.

    У больных с антителами к Lа/ SS-В отмечается выраженная инфильтрация слюнных желез иммуноглобулин-секретирующими В-клетками, синтезирующими аутоантитела. Хотя данных за непосредственное цитопатическое действие АНА при СШ не получено, без сомнения, слюнные железы являются основным местом продукции аутоантител, участвующих в образовании ЦИК и развитии иммунокомплексной патологии.

    Антитела к Rо/SS-А изолированно обнаруживаются при СШ у 20%, в сочетании с Lа/SS-В — у 40-50% больных. Если антитела к Rо/SS-А встречаются при различных аутоиммунных заболеваниях, то Lа/SS-В обычно указывают на наличие у больного СШ. Антитела к Lа/SS-В крайне редко встречаются при СКВ, протекающей с выраженными проявлениями вторичного СШ и сравнительной сохранностью функции почек.

    Комбинация обоих разновидностей АНА нередко отмечается в сочетании с высокими титрами РФ, гипергаммаглобулинемией и криоглобулинемией. Для больных с антителами к Rо/SS-А и Lа/SS-В характерно раннее начало и большая длительность заболевания, выраженное увеличение околоушных слюнных желез и значительная степень лимфоцитарной инфильтрации слюнных желез.

    Титр антител к Rо/SS-А и Lа/SS-В коррелирует со степенью лимфоцитарной инфильтрации при биопсии малых желез. Так, среди больных с умеренной степенью лимфоцитарной инфильтрации антитела к Rо/SS-А и Lа/SS-В встречаются у 20% больных СШ, в то время как при 3+ степени до 100% пациентов с СШ имеют обе разновидности этих антител. Их обнаружение у больного СШ может также прогнозировать развитие таких экстрагландулярных проявлений заболевания, как васкулит, лимфаденопатия, спленомегалия, анемия и лейкопения.

    Как уже отмечалось, антитела к Rо/SS-А и Lа/SS-В встречаются у 60% больных с перекрестными синдромами, сочетающими признаки СШ и СКВ. Таким образом, антитела к Rо/SS-А и Lа/SS-В отражают выраженность патологического процесса при СШ и отражают риск развития экстрагландулярных проявлений. Однако выявление Rо/SS-А и Lа/SS-В при СШ характеризуется сравнительно низкой чувствительностью.

    Существенное значение в диагностике СШ играет выявление антител к протокам слюнных желез, которые встречаются у 50-90% больных с СШ. Эти антитела реагируют с цитоплазмой эпителиальных клеток. Для их обнаружения применяется метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве субстрата аутопсийных человеческих тканей. Обычно у больного СШ наряду с антителами к протокам выявляются антитела к Rо/SS-А, Lа/SS-В, РФ и другие разновидности АНА.

    Среди других нередких проявлений аутоиммунного процесса при синдроме Шогрена следует упомянуть обнаружение антител к париетальным клеткам слизистой желудка, нейтрофильным цитоплазматическим антигенам (АНЦА) и антител к митохондриям.

    Как уже подчеркивалось выше, другие аутоантитела с разной частотой также обнаруживаются при СШ, что связано с поликлональной активацией В-клеточного звена иммунитета, индуцирующей образование аутоагрессивных клонов плазмоцитов. Гиперстимуляция В-клеток при СШ является причиной частого возникновения лимфопролиферативной патологии. Признаки моноклональной В-клеточной пролиферации в виде моноклонального иммуноглобулина отмечаются у 60% больных с экстрагландулярными проявлениями СШ, и практически у всех больных обнаруживаются свободные легкие цепи иммуноглобулинов в моче.

  • Антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (РСNA) [показать]

    Антитела к РСNА-1 (proliferating cell nuclear antigen) взаимодействуют с белком циклином массой 36 кДа, участвующим в контроле клеточного цикла. Этот белок появляется в клетке перед митозом и подвергается деградации после деления.

    Данные антитела впервые были описаны при СКВ, за счет характерного гранулярного окрашивания митотических клеток и характерной линии иммунопреципитации в геле. В экспериментах in vitro антитела к РСNА способны ингибировать синтез ДНК в митотических клетках, что указывает на их возможное патогенетическое значение при СКВ.

    Антитела к нему обнаруживаются у 3-5% больных с СКВ, а также могут встречаться при ревматоидном артрите. При других ревматических заболеваниях они не обнаруживаются. У больных СКВ с антителами к РСNА наряду с типичными признаками волчанки чаще выявляются диффузно-пролиферативный гломерулонефрит, поражение центральной нервной системы и тромбоцитопения. Характерно, что у больных с нейропатией и антителами к РСNА -1 отсутствуют антитела к дсДНК. Мониторинг содержания антител показал, что увеличение титра антител к РСNА -1 сопутствует обострению гломерулонефрита, а стероидная терапия снижает их титр. У больных волчанкой отмечается увеличение экспрессии РСNА -1 на мононуклеарах крови, преимущественно СD4+ и СD8+ клетках, что, возможно, объясняет индукцию этих антител при СКВ. Процент РСNА -1 позитивных клеток коррелирует с активностью заболевания.

  • Антитела к рибосомам и рибосомальному белку Р (RiboР) [показать]

    Несмотря на то, что рибосомы являются цитоплазматическими органеллами, антитела к ним причисляют к семейству АНА. Рибосомы являются органеллами, состоящими из комплексов белков и нуклеиновых кислот, их основная функция состоит в синтезе белка на основании последовательности матричной РНК. При СКВ основными антигенами являются фосфопротеиновые компоненты рибосом, прежде всего рибосомальные белки РО, Р1 и Р2.

    Антитела к рибосомам могут выявляться при использовании флюоресцентного теста и характеризуются типичным свечением цитоплазмы клетки. Иногда цитоплазматическое свечение может быть пропущено при выявлении АНФ, поэтому больные с антителами к рибосомальным белкам могут попадать в группу "АНФ негативной СКВ", что требует более детального обследования для выявления этой разновидности АНА.

    Антитела к рибосомальному белку Р высокоспецифичны для СКВ и отмечаются у 10-20% больных с СКВ. Антитела к рибосомам часто отмечаются совместно с антителами к Sm антигену. Антирибосомальные антитела встречаются преимущественно у больных с обострением СКВ. Было отмечено, что эта разновидность антител отмечается преимущественно у пациентов с поражением центральной нервной системы при СКВ, особенно при волчаночном психозе и депрессии — встречаемость антирибосомальных антител при этих состояниях составляет 50-80%. Титры антител к рибосомальному белку Р многократно увеличиваются при развитии поражения нервной системы на фоне СКВ. В диагностике поражения ЦНС при волчанке выявление антител к рибосомальному белку Р целесообразно дополнять обследованием ликвора для обнаружения олигоклонального IgG, который отражает иммуноопосредованное воспаление в ЦНС. Выявление этих антител позволяет отличить поражение ЦНС на фоне СКВ от психоза, вызванного приемом высоких доз кортикостероидных гормонов.

    Другие клинико-лабораторные взаимосвязи между обнаружением антител к рибосомам и клиникой СКВ включают развитие дискоидных высыпаний, фоточувствительность и афтозный стоматит. Имеются сведения о поражении печени у пациентов с СКВ с высокими титрами антирибосомальных антител.

  • Антитела к Кu/Кi и антитела к МА антигену [показать]

    Антитела к Кu/Кi взаимодействуют с белками ядерного матрикса массами 70 и 80 кДа. Они впервые были обнаружены у больных с перекрестным синдромом с проявлениями полимиозита и склеродермии. В последующем было показано, что они встречаются приблизительно у 10-40% в европейской популяции больных СКВ, причем обычно в высоких титрах, превышающих 1:10 000. Кроме того, они обнаруживаются при СЗСТ, склеродермии и значительно реже при полимиозите, РА, СШ, болезни Грейвза (30%) и первичной легочной гипертензии (20%).

    Антитела к МА направлены на нуклеарный кислый антиген, чувствительный к протеолизу под воздействием трипсина, но устойчивый к РНКазе и ДНКазе. Эта разновидность АНА встречается у 3-18% больных СКВ, преимущественно у больных с более активным течением заболевания.

  • Антитела к антигену Scl-70 (топоизомеразе 1) [показать]

    При СС основной разновидностью АНА являются аутоантитела против антигена Scl-70, обнаруженные Douvas в 1973 году. Эти антитела были выявлены с помощью двойной иммунодиффузии, которая долгое время являлась основным методом их обнаружения. Позднее было установлено, что основной мишенью этих антител является продукт деградации ДНК-топоизомеразы 1 массой 70 кДа.

    Топоизомераза является одним из ферментов, участвующих в механизмах деспирализации суперскрученной ДНК, необходимой для транскрипции генов. Антигенная структура топоизомеразы хорошо изучена, и основным антигеном, который используется в методах ИФА и иммуноблота, является рекомбинантный белок. Любой метод, используемый для обнаружения антител к Scl-70, может быть подтвержден при непрямой иммунофлюоресценции на клетках НЕр-2, благодаря характерному двойному типу свечения, включающему мелкогранулярный и ядрышковый типы флюоресценции. Это обуславливает целесообразность использования АНФ в качестве скрининга перед выявлением антител к Scl-70.

    Антитела к Scl-70 представлены иммуноглобулинами классов IgG и IgА, однако рутинные лабораторные тесты выявляют преимущественно антитела класса IgG.

    Антитела к топоизомеразе отмечаются при диффузной склеродермии с поражением внутренних органов (системном склерозе), однако их выявление не исключает присутствия перекрестных синдромов склеродермии с СКВ или СШ.

    Антитела к Scl-70 обнаруживаются у 70% больных СС, 30% больных с диффузной склеродермией и 10% больных с локализованными формами этого заболевания. Эти антитела практически не встречаются при других заболеваниях, за исключением первичного синдрома Рейно; в единичных случаях могут встречаться у онкологических больных без признаков СС или склеродермии. У больных с диффузной склеродермией при наличии антител к Scl-70, по сравнению с больными без этих антител, отмечается несколько более частая встречаемость рубцовых изменений на коже пальцев, развитие центрального склероза и поражение почек и сердца.

  • Антитела к центромерам [показать]

    Антицентромерные антитела были впервые описаны Таn в 1980 году при выявлении АНФ на клеточных линиях. Основным антигеном является центромерный белок СЕNР-В, который входит в состав центромер — частей хромосомы эукариот, необходимых для образования веретена деления при митозе.

    Ткани лабораторных животных слабо экспрессируют антигены центромерных антител, поэтому АНФ на клеточной линии НЕр-2 является основным методом выявления этих антител в клинике. Антитела к центромерам хорошо визуализируются на НЕр-2 клетках, благодаря свечению в делящихся клетках, в которых хромосомы компактны. Если хромосомы находятся в стадии спирализации, в ядре клетки флюоресцируют мелкие гранулы либо наблюдается картина веретена деления, подчеркнутого свечением центромер.

    Антицентромерные антитела определяются в низких титрах (до 1:40) на митотически неактивных тканях (таких как крысиная печень), но при использовании линии НЕр-2, для которых типична большая частота клеточных делений, антитела к центромерам обнаруживаются в высоких титрах.

    Иммуноблоттинг имеет лишь незначительные преимущества в связи с большей объективизацией результатов теста. Антитела к центромерам и антитела к Scl-70 редко встречаются сочетанно. Однако использование иммуноблоттинга показало, что в 10% случаев у больных с Scl-70 также отмечаются антицентромерные антитела. Часто у этих больных отмечаются также другие разновидности антинуклеарных антител, в частности, Rо/SS-А и Lа/SS-В, РМ-Scl, антимитохондриальные антитела.

    Антитела к центромерам являются серологическим маркером СRESТ-синдрома, представляющего сравнительно доброкачественную форму диффузной склеродермии, сопровождающуюся подкожными кальцинатами, синдромом Рейно, эзофагитом, склеродактилией и телангиэктазиями на коже туловища.

    Титры антител к центромерам не отражают активности заболевания. Антитела к центромерам выявляются у 50% больных с СRESТ, 20% больных с СС и 10% больных с изолированным синдромом Рейно. В этой группе пациентов отмечаются типичные клинические признаки CRESТ-синдрома: отсутствие рубцовых контрактур пальцев, более выраженный отек пальцев (по сравнению со склерозом), кальциноз фасций и сухожилий.

    При склеродермии присутствие антител к центромерам характерно для больных старшего возраста и с большей длительностью заболевания, нежели у больных со склеродермией без этих антител. Это связывают с тем обстоятельством, что у этих больных реже отмечается поражение внутренних органов, реже встречаются атрофические процессы на коже, но часто присутствует кальциноз и ишемическая гангрена пальцев кисти. Практически у всех больных с антицентромерными антителами имеется выраженный синдром Рейно.

    Антицентромерные антитела присутствуют в сыворотке 20% больных с идиопатическим синдромом Рейно, сопровождающимся артралгиями. У половины из них через несколько лет развивается полная клиническая картина склеродермии.

    Таким образом, антицентромерные антитела могут служить предвестником склеродермии и могут использоваться при дифференциальной диагностике синдрома Рейно.

    Антицентромерные антитела не выявляются у здоровых лиц даже в низких титрах, что позволяет рассматривать их обнаружение в качестве предиктора развития заболевания. Патогенетическая роль аутоантител при склеродермии остается под вопросом, изменения их титра не отражаются на активности аутоиммунного процесса, однако указывают на определенные клинические проявления этого заболевания.

    Антитела к центромерам изредка встречаются при ряде других заболеваний, сопровождающихся синдромом Рейно: СКВ, ревматоидном артрите, тиреоидите Хашимото, первичном билиарном циррозе.

  • Антитела к РМ-Scl и другим антигенам ядрышка [показать]

    К другим аутоантигенам, антитела к которым часто обнаруживаются при СС, относят компоненты ядрышка, такие как РМ-Scl, U3-RNР (фибрилларин), РНК-полимераза I, NOR90. Основным методом обнаружения этих разновидностей АНА в клинике является прицельное выявление АНФ с ядрышковым типом свечения. Антитела к РМ-Scl антигену отмечаются при сочетании клинических признаков СС и ПМ. Эта разновидность АНА направлена к антигенной системе ядрышка, включающей более 16 белков с молекулярным весом от 20 до 110 кДа.

    В случае выявления антител к РМ-Scl приблизительно у 50% больных имеет место сочетание миозита и СС, реже антитела встречаются на фоне классической картины ПМ или СС. Это сочетание получило название "склеромиозит" и характеризуется оно миозитом и миалгиями в сочетании с кожными признаками дерматомиозита (периорбитальным отеком и папулами Готрона), наряду с синдромом Рейно, склеродактилией и интерстициальным пневмонитом. У больных с антителами к РМ-Scl высок риск развития идиопатической легочной гипертензии, что приводит к быстрой декомпенсации пациентов, поэтому эти больные требуют особого внимания к функции легких.

    Антитела к РНК-полимеразам I, II и III отмечаются у 20% больных с СС, CRESТ и перекрестными синдромами. В иммунофлюоресцентном тесте отмечается своеобразный точечный ядрышковый тип свечения. Эти антитела встречаются изолированно, без антител к центромерам и Scl-70. Антитела к полимеразам связаны с диффузным поражением кожи и внутренних органов, в том числе сердца и почек.

    Антитела к фибрилларину (U3-RNР) — одному из основных ядрышковых рибонуклеопротеинов — отмечаются у 6-8% больных склеродермией. Иммунофлюоресценция обнаруживает антиядрышковый тип свечения со значительной конденсацией и интенсивным свечением хроматина в клетках, находящихся в процессе митоза. Антитела к фибрилларину встречаются у больных с агрессивным прогрессирующим системным склерозом с вовлечением внутренних органов, в том числе поражением тонкого кишечника, легочной гипертензией, миозитом, и указывают на неблагоприятный прогноз.

    Антитела к РНКазе (RNАазе) направлены на один из ядрышковых рибонуклеопротеинов, связанных с процессингом митохондриальной РНК. Они встречаются у 4-11% больных склеродермией. Их присутствие в сыворотке типично для поражения тонкого кишечника, гипотиреоза, артрита и локализованной кожной формы склеродермии.

    Антитела к NOR90 взаимодействуют с белком массой 90 кДа — компонентом ядрышкового организатора, участвующего в сборке ядрышка после митоза. При выявлении АНФ в ядре клетки-субстрата обнаруживаются 10-20 мелких дискретных точек, причем интенсивность окраски меняется в зависимости от фазы жизненного цикла клетки. Этот тип АНА неспецифичен при склеродермии и встречается при СКВ, ревматоидном артрите, некоторых формах онкологических заболеваний.

  • Миозит-специфические АНА: антитела к тРНК-синтетазам анти-Jо-1, РL-7, РL-12, ЕJ и 0J), антитела к Мi-2 антигену, SRРи р56 [показать]

    Полиморфную группу заболеваний, характеризующихся цитотоксическим ответом в отношении компонентов поперечно-полосатой мускулатуры часто объединяют под названием "воспалительные миопатии". К ним относят классический дерматомиозит, миозит в рамках перекрестных синдромов, полимиозит и паранеопластический полимиозит, а также миозит с внутриклеточными включениями. Конкретные разновидности АНА при ПМ/ДМ условно подразделяют на миозит-специфические и миозит-ассоциированные, то есть АНА, которые встречаются также при других формах ДБСТ в рамках перекрестных синдромов.

    Классификация аутоантител при миозите приведена в табл. 15. При воспалительных миопатиях миозит-специфические антитела могут быть обнаружены в 40% случаев, в то время как миозит-ассоциированные АНА отмечаются у 20-30% больных. Общая частота АНА даже при развернутых формах с классической картиной полимиозита не превышает 60%.

    К семейству миозит-спефицифических АНА относятся три основные разновидности аутоантител: антитела к аминоацил-тРНК-синтетазам, антитела к белку Мi-2 и антитела к компонентам сигнал-распознающей частицы SRР.

    Таблица 15. Классификация АНА при воспалительных миопатиях Разновидности АНА % обнаружения Комментарий Миозит-специфические антитела Антитела к тРНК-синтетазам (анти-Jо-1, РL-7, РL-12, ЕJ и 0J) 25% Маркеры "антисинтетазного синдрома", сочетающего характерные кожные и системные проявления Антитела к белку Mi-2 10% Встречаются при классическом дерматомиозите с выраженными кожными проявлениями Антитела к компонентам сигнал-распознающей частицы SRР 3% Характерно тяжелое течение полимиозита с поражением дыхательных мышц и миокардитом Миозит-ассоциированные антитела Антитела к РМ-Scl 10% Встречаются у больных с перекрестным синдромом, объединяющим признаки диффузной склеродермии и полимиозита Антитела к U1-RNР 10% Маркер "смешанного заболевания соединительной ткани" Антитела к SS-А 3% Частая разновидность АНА

    Наиболее обширное семейство миозит-специфических аутоантител представляют собой антисинтетазные антитела. Это семейство насчитывает 5 основных представителей: Jо-1, РL-7, РL-12, ЕJ и OJ, которые сочетание отмечаются у 20-30% больных ДМ/ПМ. Антитела, взаимодействующие с Jо-1 антигеном, отмечаются в несколько раз чаще, чем другие антисинтетазные антитела, и именно у больного с ДМ/ПМ они были впервые описаны (Nishikai и Reichlin, 1980). Эти антитела реагируют с гистидил-тРНК-синтетазой, в то время как остальные антисинтетазные антитела направлены против 4 различных типов тРНК-синтетаз — треониновой, аланиновой, глициновой, изолейциновой.

    Антитела Jо-1 выявляются при использовании контрэлектрофореза и иммуноферментного анализа, что позволяет широко применять определение этого типа АНА в лабораторной практике. Контрэлектрофорез обладает достаточной чувствительностью и специфичностью для рутинной работы и представляет собой метод выбора для обнаружения антител к Jо-1.

    Хотя антисинтетазные антитела не включены в классификационные критерии ДМ (Bohan и Peter, 1975), их обнаружение при соответствующей клинической картине с высокой достоверностью подтверждает диагноз и в ряде случаев делает ненужной биопсию ткани. Так как антитела к тРНК-синтетазам обладают низкой чувствительностью при ДМ/ПМ, их отсутствие не может опровергнуть диагноз ДМ или ПМ.

    Антитела к Jо-1 отмечаются у 15-20% больных ДМ/ПМ. Предполагается, что более широкое внедрение тестирования в отношении других антисинтетазных антител может удвоить эту цифру.

    У всех больных с антисинтетазными антителами наблюдается очень сходная клиническая картина, что привело к выделению особой клинико-лабораторной рубрики — так называемого "антисинтетазного синдрома", одной из разновидностей перекрестных синдромов. Он проявляется клинической картиной дерматомиозита, но протекает более активно и требует назначения активной иммуносупрессивной терапии. Около 90% больных с антисинтетазным синдромом страдают симметричным полиартритом, часто отмечается синдром Рейно. Для этих больных характерна особая форма поражения кожи, так называемая "рука механика", с гиперпигментацией, гиперкератозом и трещинами по латеральным и пальмарной поверхностям пальцев, напоминающая забитые грязью складки на коже рабочего. Интерстициальное поражение легких, или фиброзирующий альвеолит, встречается у 50-75% больных с антителами к тРНК-синтетазам. Приблизительно у 1/5 больных с антисинтетазными антителами отмечаются признаки другого заболевания соединительной ткани.

    Больные с антисинтетазными антителами хуже поддаются терапии, и у них чаще возникают обострения при снижении доз иммуносупрессивных препаратов. Имеются данные относительно большей эффективности цитостатиков, в частности метотрексата, у этой категории больных. Антитела к Jо-1 иногда встречаются у единичных больных с интерстициальными заболеваниями легких, например у 3% больных с криптогенным фиброзирующим альвеолитом, и еще реже при неэрозивных артритах.

    Антисинтетазные антитела появляются еще до начала клинических проявлений ДМ/ПМ и изменения их титра не несут значимой клинической информации, в связи с чем повторное исследование играет только подтверждающую роль. Присутствие Jо-1 в сыворотке практически исключает диагноз полимиозита с включениями.

    Антитела к Мi-2 антигену реагируют с ядерным антигеном, входящим в состав ЭНА. Эта разновидность аутоантител была первым антителом, описанным при ДМ. Антитела к Мi-2 являются наиболее специфичным серологическим маркером ДМ, а также встречаются при ювенильном ДМ. Данная разновидность АНА может быть обнаружена благодаря гомогенному типу свечения АНФ и выявляется у 10-20% больных с ДМ, с выраженными признаками поражения кожи. У этих больных наблюдается в целом благоприятное течение заболевания и хороший ответ на иммуносупрессивную терапию.

    У 3% больных с полимиозитом взрослых имеются антитепа к белкам сигнап-распознающей частицы (SRР — signal recognition particle), цитоплазматическому комплексу, транспортирующему белки в эндоплазматический ретикулум. У таких больных отмечается тяжелое агрессивное течение заболевания, протекающее обычно с поражением миокарда, плохо поддающееся терапии, с высокой летальностью. Активно изучается диагностическое значение АНА, направленных против белка массой 56 кДа (р56) и отмечающихся почти у 90% больных с ювенильным дерматомиозитом и у 50% больных с традиционным ДМ/ПМ.

Антитела к фосфолипидам и ложноположительная РВ

Под термином "антифосфолипидные" антитела подразумевают семейство аутоантител, направленных к фосфолипидным компонентам клеточных мембран. Однако такое название не отражает самой сущности взаимодействия антифосфолипидных антител со своими антигенами, в котором наряду с фосфолипидами важную роль играют белковые кофакторы этих аутоантител, одним из которых является бета2-гликопротеин I.

Основными представителями семейства антифосфолипидных антител являются антитела к кардиолипину, антитела к бета2ГП I, а также волчаночный антикоагулянт. Кроме того, антикардиолипиновые антитела перекрестно реагируют с фосфатидилсерином и другими отрицательно заряженными фосфолипидами, антителами к тромбоцитам, антителами к окисленным липопротеидам низкой плотности и протромбином.

Первым методом обнаружения антифосфолипидных антител стал серологический тест для диагностики сифилиса, который был разработан Вассерманом в 1906 году. В 1941 году была уточнена природа основного антигена, входящего в экстракт бычьих сердец, который был назван "кардиолипином" (Pangborn, 1941). Активное использование этого лабораторного теста привело к тому, что была выделена категория пациентов, у которых определялась положительная реакция Вассермана, однако признаков сифилиса не отмечалось. Кроме того, у лиц с ложноположительным серологическим тестом была отмечена высокая распространенность аутоиммунных заболеваний, прежде всего ДБС и СШ. Этот феномен получил название "биологически ложноположительный тест на сифилис".

Позднее в плазме пациентов с ложноположительной реакцией Вассермана был обнаружен сывороточный фактор, препятствовавший свертыванию крови, который в 1972 году получил название "волчаночный антикоагулянт" (Feinstein и Rappaport, 1972). Волчаночный антикоагулянт отсутствовал в плазме пациентов с истинно положительной реакцией Вассермана и часто отмечался у пациентов с СКВ. У пациентов с ВА отмечался характерный набор клинических проявлений, среди которых ведущими являются тромбозы артерий и вен, повторные выкидыши и тромбоцитопения, составляющие симптомокомплекс АФС (Hughes, 1993). Интерес к диагностике этого заболевания значительно возрос в течение последних 15 лет в связи с разработкой более совершенных тестов для выявления антифосфолипидных антител (АФА).

Ложноположительная реакция Вассермана (или RPR) характерна для АФС при отрицательных результатах других специфических тестов для диагностики трепонемной инфекции. В то же время другой распространенный серологический метод диагностики сифилиса — VDRL — в меньшей степени зависит от присутствия антифосфолипидных антител.

Больные с ложноположительной РВ делятся на две группы: больные с транзиторно-положительной РВ, у которых часто отмечаются острые вирусные и бактериальные инфекции, и больные с постоянно положительной РВ, присущей таким аутоиммунным заболеваниям, как АФС либо СКВ.

  • Антитела к кардиолипину [показать]

    Антитела к фосфолипидам являются основным серологическим маркером антифосфолипидного синдрома (АФС), патологического состояния, тесно связанного с ДБСТ.

    АФА представляют собой гетерогенную популяцию иммуноглобулинов, взаимодействующих с отрицательно заряженными фосфолипидами. Эти антитела нарушают образование протромбинактивирующего комплекса, который состоит из фактора 10, фактора 5, фосфолипидов из тромбоцитов и кальция. Для взаимодействия АФА и фосфолипидов необходим сывороточный кофактор, в качестве которого выступает бета2-гликопротеин I (бета2-ГП I). В настоящее время предполагается, что антитела к бета2-ГП I играют основную роль в патологии коагуляции у больных АФС, в то время как антифосфолипидные антитела сами по себе не участвуют в патогенезе тромбозов у этих пациентов.

    Основным методом обнаружения антифосфолипидных антител является ИФА, в котором в качестве основного антигена выступают комплексы кардиолипина и 6ета2-ГП I — так называемые бета2-ГП 1-зависимые антикардиолипиновые антитела. Важным требованием к ИФА-наборам для обнаружения АФА является наличие в тестируемом фосфолипидном субстрате бета2-ГП I; кофактор обычно присутствует в составе буферов для разведения сыворотки больных.

    Хотя оригинальный метод подразумевает применение кардиолипина, в качестве антигена могут быть использованы другие отрицательно заряженные фосфолипиды, в частности фосфатидилсерин или фосфатидилинозитол. Целесообразность выявления антител к другим представителям фосфолипидов в практической диагностике сомнительна.

    Разработаны стандарты сыворотки для выявления антикардиолипиновых антител классов IgG и IgМ, выраженных в GPL и МРL единицах соответственно. Одна единица представляет собой связывающую активность 1 мкг/мл аффинно очищенных антикардиолипиновых антител. Необходимо определение АКЛА обоих классов, так как аутоантитела могут встречаться независимо друг от друга. Результаты обследования рекомендуется интерпретировать с помощью градации на низкие, умеренно повышенные и высокие титры антител, которые соответствуют менее 20 единицам, промежутку между 20 и 80 единицами и более 80 единицам. Антикардиолипиновые антитела могут быть обнаружены как в сыворотке, так и в плазме крови. Инактивация комплемента нагреванием может приводить к ложноположительным результатам, а повторное замораживание приводит к снижению титров аутоантител.

    Антитела к кардиолипину в низких и средних титрах отмечаются у 30-40% пациентов с СКВ, что позволяет использовать их в качестве одного из серологических маркеров этого заболевания. Их выявление не коррелирует с возрастом, длительностью заболевания или особыми чертами его течения, включая наличие полиартрита, серозита или васкулита. В то же время наличие высоких титров антикардиолипиновых антител указывает на риск развития вторичного АФС на фоне СКВ. СКВ не является единственным ревматологическим заболеванием, сопровождающимся антифосфолипидными антителами. Сравнительно часто антитела к кардиолипину присутствуют у больных с васкулитами и васкулитоподобными состояниями, например при синдроме Бехчета и болезни Крона.

    Антитела к кардиолипину наряду с волчаночным антикоагулянтом являются основным серологическим маркером АФС и составляют лабораторные критерии этого заболевания. Титры АКЛА обычно максимальны непосредственно перед развитием тромбоза и несколько снижаются сразу после его возникновения, что свидетельствует об их потреблении в процессе коагуляции. Увеличения титра АКЛА при развитии клинической картины тромбоза служит основой для постановки диагноза АФС.

    В то же время антикардиолипиновые антитела являются одними из наиболее распространенных аутоантител, присутствующих у клинически здоровых лиц. Значимые концентрации антикардиолипиновых антител появляются на фоне широкого спектра инфекционных заболеваний. Среди наиболее частых индукторов антикардиолипиновых антител описаны инфекции, вызванные вирусом гепатита С, ВИЧ, вирусом Эпштейна-Барр, парвовирусом В19, стрептококками, Н. pylori, а также сальмонеллез, инфекции мочевыводящих путей. Обычно при инфекциях появляются низкие титры антикардиолипиновых антител класса IgМ, котoрые плавно снижаются после выздоровления. Это требует повторных определений антикардиолипиновых антител с перерывом в 1,5 месяца, что соответствует времени обновления пула иммуноглобулинов сыворотки. Онкологические заболевания, хронические интоксикации, в том числе алкоголизм, индуцируют антифосфолипидные антитела, что обуславливает сложность интерпретации этого показателя (см. соответствующий раздел).

  • Антитела к бета2-гликопротеину I [показать]

    Бета2-ГП I представляет собой гликозилированный белок плазмы крови, содержание которого в норме составляет около 150-300 мкг/мл. Хотя его функции окончательно не установлены, однако известно, что он обладает антикоагулянтной активностью. Он способен связываться с апоптотическими тельцами и участвует в клиренсе апоптотических телец из кровотока.

    Антитела к бета2-ГП I распознают исключительно человеческий белок и отмечаются у 70-80% больных с АФС. Антитела к бета2-ГП I низкоаффинны и их содержание обычно невелико. Литературные данные, посвященные их использованию в диагностике АФС противоречивы. Хотя в ряде литературных источников, выявление антител к бета2-ГП I рассматривается в качестве основного метода диагностики АФС, тесты по выявлению антител плохо стандартизованы. Существуют значительные противоречия в вопросе, аутоантитела какого класса необходимо выявлять при АФС. На сегодняшний день выявление антител к бета2-ГП I следует рассматривать в качестве лабораторного метода, дополняющего выявление антикардиолипиновых антител. Рекомендуется их использование у пациентов с клиническими признаками АФС, у которых не было обнаружено антикардиолипиновых антител и волчаночного антикоагулянта.

  • Волчаночный антикоагулянт [показать]

    Хотя антитела к фосфолипидам индуцируют тромбозы in vivo, однако in vitro они приводят к замедлению фосфолипидзависимых коагуляционных тестов, прежде всего активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и, в меньшей степени, протромбинового времени. Выявление волчаночного антикоагулянта является функциональным тестом, который позволяет оценить действие антител на каскад коагуляции. Выявление ВА, наряду с клиническими проявлениями и выявлением антител к кардиолипину, входит в состав критериев диагностики АФС (табл. 16).

    Таблица 16. Развернутые критерии АФС

    Клинические критерии

    Сосудистые тромбозы, один или несколько эпизодов артериального, венозного или тромбоза мелких сосудов в любой ткани или органе, за исключением тромбоза поверхностных вен. Тромбоз должен быть подтвержден КТ/МРТ, допплеровским исследованием или морфологически. При морфологическом исследовании тромбоз не должен сочетаться с воспалительными изменениями стенки сосуда.

    Невынашивание беременности: одна или более смерть плода от 10 и более недель беременности, подтвержденная нормальной морфологией плода при ультразвуковом исследовании или морфологически;

    либо
    одни или более преждевременные роды морфологически нормального новорожденного на сроке от 34 недель беременности в результате тяжелой преэклампсии, эклампсии или плацентарной недостаточности;

    либо
    три или более необъяснимых спонтанных аборта на сроке до 10 недель беременности, при исключении анатомических, гормональных и генетических причин невынашивания.

    Лабораторные критерии

    Антикардиолипиновые антитела: подразумевающие повторное выявление средних или высоких титров антител классов IgG и IgМ два или более раз, с промежутком между исследованиями не менее 6 недель, определенными с помощью метода ИФА для обнаружения бета2-ГП I зависимых антикардиолипиновых антител.

    Волчаночный антикоагулянт: обнаруженный два или более раз, с промежутком между исследованиями не менее 6 недель, с помощью комплекса из скринингового, подтверждающего и корректирующего коагулогических тестов

    Коагулогические тесты для обнаружения ВА делятся на скрининговые, коррекционные и подтверждающие. Крайне важным является соблюдение преаналитического этапа метода, так как присутствие в исследуемой плазме тромбоцитов, которые являются эндогенным источником фосфолипидов, может привести к ложноотрицательным результатам теста.

    В качестве скрининговых тестов используется АЧТВ с фосфолипид-зависимым субстратом, коалиновое время свертывания и тест с ядом гадюки Рассела. Необходимо использование, по крайней мере, двух коагуляционных тестов. В случае если оба или хотя бы один из них указывает на наличие ВА, необходимо выполнить коррекционный тест, то есть повторить тест с добавлением нормальной человеческой плазмы. Отсутствие коррекционного действия плазмы здорового донора позволит отличить волчаночный антикоагулянт от врожденных коагулопатий, связанных с дефицитом одного из факторов каскада свертывания.

    Наконец, подтверждающий тест с добавлением избытка фосфолипидов позволяет нейтрализовать действие ингибирующих аутоантител и подтвердить присутствие специфических АФА. Как и в случае обнаружения АКЛА, необходимо подтвердить перманентный характер присутствия ВА в сыворотке, так как ВА может появляться на фоне вирусных и бактериальных инфекций, под действием ряда лекарственных препаратов.

    Важно учитывать, что назначение терапии антикоагулянтами, прежде всего гепарином, ведет к удлинению АЧТВ и других скрининговых тестов. Это в определенной степени затрудняет выявление ВА у пациентов, которым антикоагулянтная терапия была начата по жизненным показаниям. В данном случае большую специфичность при диагностике АФС имеют серологические тесты.

Классификация антител при ревматоидном артрите

Ревматоидный артрит (РА) является одним из наиболее частых ревматических заболеваний и сопровождается поликлональной активацией В-клеток с гипергаммаглобулинемией и синтезом широкого спектра аутоантител. При ревматоидном артрите (РА) может быть обнаружено до 50 различных видов аутоантител, которые могут встречаться с разной частотой.

В качестве специфических серологических маркеров при РА рассматриваются ревматоидный фактор (РФ) и антитела к цитруллинированным антигенам (АЦА), а также антитела RА33, которые являются одной из разновидностей АНА (табл. 17).

Таблица 17. Аутоантитела в лабораторной диагностике РА Название Источник антигена Мишень антитела Антинуклеарные антитела Клетки линии НЕр-2 Анти-SS-A (52 кДа), RA-33 Ревматоидный фактор Иммуноглобулин IgG Ga-эпитоп в Fс-фрагмента Антикератиновые антитела Ороговевающий слой эпителия пищевода Профилаггрин крысы Антиперинуклеарный фактор Кератогиалиновые гранулы Филаггрин человека Антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептиду (АЦЦП) Пептид, содержащий аминокислоту цитруллин Иммунодоминантный эпитоп филаггрина Антитела к Sа антигену Ткань плаценты Цитруллинированные формы виментина

Под названием "ревматоидный фактор" понимают аутоантитела, представленные иммуноглобулинами всех классов, реагирующие с Fс-фрагментом человеческого или животного IgG.

Семейство АЦА насчитывает 5 основных разновидностей. С белком филлагрином реагируют только антиперинуклеарный фактор и антикератиновые антитела, в то время как другие представители этого семейства направлены на другие антигенные мишени, содержащие аминокислоту цитруллин. Цитруллин-содержащие антигены рассматриваются в качестве основных мишеней антифилаггриновых антител (АФА), поэтому АФА можно рассматривать как частный случай аутоантител, направленных к цитруллин-содержащим белкам.

Только у 30% больных РА может быть обнаружен АНФ, что не позволяет причислять АНФ к серологическим маркерам этого заболевания. Среди семейства антител к антигенам ядер только антитела к RА-33 высокоспецифичны для этого заболевания, и, несмотря на их низкую встречаемость, составляющую около 30%, они обычно рассматриваются в числе антител, характерных для РА.

  • Ревматоидный фактор [показать]

    Первой разновидностью аутоантител, обнаруженных при РА, явилось открытие РФ Waaler Е. в 1940 году. Основной мишенью РФ является эпитоп Gа, расположенный в тяжелой цепи молекулы IgG подклассов IgG1, IgG2, IgG4, недалеко от сайта связывания со стафилококковым протеином А. К РФ причисляют антитела против IgG, представленные основными классами иммуноглобулинов — IgG, IgМ и IgА. Хотя РФ может быть представлен любым классом иммуноглобулинов, но турбидиметрические и агглютинационные тесты предпочтительно выявляют IgМ-РФ. В латексном тесте агрегированный человеческий IgG прикреплен к латексным частицам, которые агглютинируют в присутствии РФ. Это быстрый, легко выполнимый тест, однако он дает большое количество ложнопозитивных результатов.

    Среди агглютинационных тестов классический тест Ваалера-Розе, основанный на пассивной гемагглютинации с использованием эритроцитов барана, покрытых антиэритроцитарной сывороткой крови кролика, до сих пор не утратил своего значения. По сравнению с латексным и другими агглютинационными тестами положительный тест Ваалера-Розе является более специфичным для ревматоидного артрита, так как аллотипические антитела, появляющиеся при беременности или после гемотрансфузий, не взаимодействуют с кроличьим IgG. В ряде случаев, тем не менее, гетерофильные антитела к эритроцитам барана, встречающиеся при инфекционном мононуклеозе и ряде других острых инфекций, способны привести к ложноположительному результату этого теста.

    Нефелометрия и турбидиметрия являются наиболее точными аналитическими методами для определения РФ. Рассеивание света на формирующихся комплексах антиген-антитело позволяет установить их концентрацию в сыворотке крови. Этот тест является наиболее стандартизированным среди всех иммунологических тестов, и его применение позволяет быстро и точно получить результат в IU/мл (international units). Результаты нефелометрического определения РФ хорошо согласуются с традиционным латексным тестом. Точное определение класса иммуноглобулинов, которым представлен РФ, может быть выполнено с помощью метода ИФА. Убедительных данных о целесообразности определения классов РФ в клинике нет. Тем не менее отмечается, что IgG-РФ выявляется при васкулитах, сопутствующих РА и синдрому повышенной вязкости крови, поскольку он может участвовать в образовании самоассоциирующихся иммунных комплексов. У больных с IgА-РФ отмечается быстропрогрессирующее течение заболевания.

    Для стандартизации тестов по обнаружению РФ ВОЗ разработан международный стандарт сыворотки WHO1066, содержащий 100 IU/мл РФ. Существующие стандарты сыворотки учитывают РФ класса IgМ, таким образом, в международных единицах IU/мл) может быть получен ответ для РФ, представленный этим классом.

    В качестве популяционной нормы рекомендуется рассматривать концентрации РФ ниже 20 IU/мл. Частота выявления концентраций РФ, превышающих 20 IU/мл, у здоровых людей среднего возраста составляет около 3% и увеличивается до 10-15% у пожилых старше 65 лет. Концентрация РФ в сыворотке крови больного, превышающая 40 IU/мл, должна рассматриваться как высокая и является высокоспецифичной для диагностики РА. Обнаружение титров РФ более 40 IU/ мл указывает на высокий риск развития эрозивного артрита. У тех лиц, у которых был выявлен высокий титр РФ, отмечается значительный риск развития РА, так как обнаружение диагностических титров РФ может предшествовать клиническим проявлениям заболевания с опережением в несколько лет.

    До сих пор выявление РФ является основным лабораторным методом диагностики РА, что и послужило основанием для выделения двух его основных клинико-иммунологических разновидностей: серонегативного и серопозитивного. Более того, отсутствие РФ при ряде воспалительных артритов позволяет выделить клиническую группу серонегативных спондилоартропатий. Общепризнано, что РФ обладает достаточно высокой чувствительностью и отмечается у 60-80% больных РА. Однако в дебюте заболевания, на этапе раннего РА, РФ обнаруживается менее чем у 25% больных, что значительно снижает его значение для ранней диагностики этого заболевания.

    Однократное определение РФ на ранней стадии РА, принесшее отрицательный результат, недостаточно для того, чтобы исключить серопозитивную клинико-иммунологическую форму РА. Если диагноз РА подозревается или даже клинически подтвержден при отрицательном результате теста по определению РФ, требуются повторные определения его титра каждые 6 или 12 месяцев. Этот срок приблизительно соответствует времени обновления пула плазматических клеток, способных синтезировать аутоантитела. Если же будет получен положительный результат, то нет реальных предпосылок повторять определение РФ с течением времени, так как титры аутоантител плохо отражают активность заболевания.

    Значение повторных определений содержания РФ для контроля за течением заболевания имеет несравненно меньшее значение, чем мониторинг острофазного ответа. Снижение титра РФ в плазме крови при успешной терапии может отчасти объясняться цитостатическим эффектом применяемых препаратов.

    Таблица 18. Частота встречаемости РФ при различных заболеваниях и у здоровых Группы обследованных Приблизительная частота Pевматоидный артрит 80% Синдром Шогрена 70% Смешанная криоглобулинемия 70% СКВ 30% Полимиозит 20% Системный склероз 20% Подострый септический эндокардит 40% Цирроз печени 25% Инфекционный гепатит 25% Туберкулез 15% Саркоидоз 10% Сифилис 10% Здоровые (общая популяция) <5% Пожилые (>70 лет) 15% Приведены данные латекс-агглютинационного теста

    Тем не менее, у больных РА возможна сероконверсия как в одну, так и в другую сторону в зависимости от активности и длительности заболевания, а также от проводимого лечения. Сероконверсия из серопозитивной в серонегативную группу встречается редко и обычно сопутствует полной клинической ремиссии заболевания. Кроме низкой встречаемости РФ в дебюте заболевания, очевидным недостатком РФ в качестве маркера РА является его сравнительно низкая специфичность, ко¬торая не превышает 60% (табл. 18).

    Высокие уровни РФ часто встречаются при синдроме Шогрена, гранулематозе Вегенера, аутоиммунных поражениях печени, СКВ, криоглобулинемии, реже при многих других аутоиммунных заболеваниях, а также хронических инфекциях, в частности подостром септическом эндокардите, туберкулезе, вирусном гепатите С.

    Хотя РФ входит в классификационные критерии РА, его обнаружение не позволяет доказать РА при атипичной клинической картине, а отсутствие РФ в сыворотке больного не позволяет исключить диагноз РА. Так, симметричный полиартрит, характерный для РА, отмечается у больных СКВ, СШ, ПМ, вирусными инфекциями и другими заболеваниями, также часто сопровождающимися обнаружением РФ в сыворотке. В то же время РФ встречается при других заболеваниях соединительной ткани и практически всегда сопровождается АНА. Так, при синдроме Шогрена выявление у больного РФ обычно сопутствует Rо/SS-А, а при волчанке РФ обнаруживается у больных с антителами к дсДНК.

  • Антитела к цитруллинированным антигенам [показать]

    Первым исследованным аутоантителом, относящимся к этому семейству, был антиперинуклеарный фактор (АПФ). При РА впервые АПФ был описан голландскими исследователями Neinhuis и Mandema (1964). Эта разновидность аутоантител получила свое название за счет способности к связыванию с кератогиалиновыми гранулами в цитоплазме клеток эпителия щеки человека, расположенными перинуклеарно (рис.8).

    Основным методом выявления АПФ является непрямая иммунофлюоресценция. Оптимальным тест-субстратом для выявления АПФ являются эпителиальные клетки слизистой щеки человека, в которых обнаруживается специфическое свечение крупных округлых гранул (3-8 на клетку), расположенных вокруг ядра.

    Выявление АПФ сопряжено с рядом технических сложностей, что ограничивает широкое практическое применение этого метода. Прежде всего, лишь около 5-10% здоровых лиц обладают достаточным содержанием кератогиалиновых гранул в клетках эпителия щеки, и для стандартизации метода необходим подбор подходящего донора. Кроме того, кератогиалиновые гранулы быстро утрачивают свою антигенность при длительном высушивании клеток, большинстве типов химической фиксации, обработке ферментами и детергентами.

    Как и при выявлении большинства других видов аутоантител, использование непрямой иммунофлюоресценции для определения АПФ обладает большей специфичностью по сравнению с иммуноферментным методом, однако не лишено субъективности при учете результатов теста. Другим представителем семейства антифилаггриновых антител являются антикератиновые антитела (АКА), описанные Young B.J. в 1979 году. Они также выявляются с помощью непрямой иммунофлюоресценции и реагируют с роговым слоем многослойного плоского ороговевающего эпителия средней трети пищевода крысы (рис. 9).

    При использовании пищевода крысы в реакции непрямой иммунофлюоресценции выявляется несколько типов окрашивания эпителия. Может визуализироваться окрашивание клеток базального слоя эпителия, наблюдаться сетчатое окрашивание неороговевающих слоев эпителия, а также гранулярное окрашивание stratum corneum.

    Для АКА характерен особый, линейный тип окрашивания ороговевающих слоев эпителия пищевода крысы, в то время как остальные типы окрашивания специфического диагностического значения не имеют. Необходимо учитывать, что на пищеводе могут быть также обнаружены аутоантитела к десмосомам и антитела к базальной мембране, которые являются специфическими маркерами буллезных дерматозов. Эти антитела также способны интерферировать с выявлением АКА и должны быть дифференцированы от АКА.

    Референтная сыворотка ВОЗ 61/4, наряду с РФ, содержит АПФ и АКА и может быть использована для стандартизации обоих тестов. Работами группы Serre G. et al. (1993) было установлено, что АКА и АПФ направлены на общую антигенную мишень, что позволило отнести их к общему семейству аутоантител, которое получило название "антифилаггриновые антитела".

    Основным антигеном АФА является белок профилаггрин, который синтезируется в виде фосфорилированного полипептида, содержащего около 10 филаггриновых повторов. Белок хранится в гранулах и подвергается ограниченному протеолизу, после чего положительно заряженные полипептиды филаггрина участвуют в сборке цитокератинового скелета эпителиоцита. Именно профилаггрин локализуется в кератогиалиновых гранулах эпителиоцитов щеки человека, которые выступают в качестве субстрата выявления АПФ. В ороговевающем эпителии человека аутоантитела реагируют с изоформами филаггрина массой 37 и 40 кДа, в то время как в эпителии крысы основными антигенами являются три профилаггрин-ассоциированных белка, массами 210 кДа, 90-120 и 60-130 кДа.

    Филаггрин отсутствует в тканях сустава, и причина появления АФА долгое время оставалась неизвестной. В середине 90-х гг. той же группой французских исследователей, возглавляемой Serre G., было установлено, что АФА связываются с разными антигенными мишенями, содержащими аминокислоту цитруллин, образующуюся при дезаминировании аргинина с помощью фермента пептидил-аргинин-дезаминазы (ПАД). К таким мишеням относятся филаггрин, виментин, а также Sа-антиген, выделенный из ткани плаценты, антитела к которому также причисляют к семейству АЦА.

    Высокая активность ПАД наблюдается в воспаленной синовиальной оболочке, что было показано при исследовании ее биоптатов у больных РА и на моделях этого заболевания у лабораторных животных. Основным источником ПАД в синовиальной оболочке могут быть полиморфноядерные лейкоциты, содержащие этот фермент в цитоплазме, которые в значительном количестве появляются в синовиальной жидкости при РА. Их разрушение приводит к высвобождению свободного фермента и его активации в присутствии ионов кальция. Наличие цитруллинированных белков особенно характерно для воспалительно-измененной синовиальной оболочки при РА, где они выступают в качестве основной мишени АЦА.

    Основными индукторами появления АЦА рассматриваются альфа- и бета-цепи дезиминированного фибрина, которые в большом количестве накапливаются в воспаленной синовиальной оболочке и ко-локализуются с отложениями цитруллинированных белков.

    Значительным достижением в изучении роли цитруллин-содержащих антигенов при РА явилось исследование Schellekens G.A. еt а1. (1998), в котором были описаны линейные иммунодоминантные пептиды филаггрина, содержащие цитруллин.

    Всего было проанализировано 40 цитруллинированных пептидов, которые позволили выделить основной иммунодоминантный пептид cfc1, в состав которого входили 19 аминокислот (306-324, Аrg312 -->Сit). За счет замены серина на цистеин был создан сfс1-сус, пептид, содержащий цистеиновый мостик, или циклический цитруллинированный пептид (cyclic citrullinated peptide - ССР), более точно отражающий информационную структуру нативного белка, что увеличило сродство АЦА к этому антигену.

    Эти исследования позволили разработать иммуноферментную тест-систему для выявления антител к циклическому цитруллин-содержащему пептиду (АЦЦП), что упростило выявление АЦА в клинических лабораториях. В настоящее время создана вторая генерация тестов для выявления АЦЦП, которые обладают повышенной чувствительностью. Последовательность циклического цитруллинированного пептида уникальна и выбрана из случайных петидных библиотек, в которые входили пептиды, содержащие цитруллин. Патент на аминокислотную последовательность принадлежит голландской фирме Еиrо-Diagnostica, и антиген доступен коммерчески. Это в значительной мере стандартизирует выявление АЦЦП во всем мире. Взаимосвязь между антигенными мишенями, с которыми реагируют АЦА, представлена на рис. 10.

    Среди прочих антител, встречающихся при РА, антитела к цитруллинированным антигенам занимают особое место в связи с их высокой специфичностью при РА, достигающей 95%. Наряду с РФ их выявление представляет признанный лабораторный тест для практической диагностики РА.

    Со времени первого описания АКА при ревматоидном артрите их диагностическое значение неоднократно подтверждалось. Встречаемость АКА в сыворотке крови больных РА, по данным разных авторов, составляет около 45% при серопозитивном и 30% при серонегативном РА, при специфичности, близкой к 100%. Несколько чаще обнаруживается АПФ, и его встречаемость составляет 45-61%. По сравнению с РФ, для АКА и АПФ характерна более высокая специфичность, которая составляет 88-99%, при более низкой чувствительности, не превышающей 60%. Полагают, что АПФ менее специфичен по сравнению с АКА и чаще встречается при других ревматологических заболеваниях.

    Содержание АКА и АПФ, а также АЦЦП у больных РА не коррелирует с титрами РФ, что позволяет рассматривать эти антитела в качестве независимых серологических маркеров заболевания. АФА встречаются у пациентов с серонегативным РА, что значительно сокращает группу больных РА, у которых не выявляются специфические серологические маркеры заболевания.

    Выявление АПФ и АКА является важным серологическим методом ранней диагностики РА. Обнаружение АКА может предшествовать клиническим проявлениям РА. В замороженных образцах сыворотки крови АКА обнаруживались в четверти случаев за 5 лет и менее до дебюта РА, в 10% случаев — за 5-9 лет, и в 8% случаев — за 10 и более лет. У больных ранним РА диагностическая чувствительность АПФ превышала таковую для РФ. Это позволяет широко использовать АКА и АПФ в дифференциальной диагностике суставного синдрома неясного генеза. Метод второй генерации для выявления АЦЦП практически не уступает по чувствительности РФ и позволяет обнаружить антитела у 70-80% пациентов РА. Таким образом, по чувствительности этот метод сопоставим с выявлением РФ, однако он значительно превосходит последний благодаря специфичности, составляющей около 95%.

  • Другие разновидности АЦА [показать]

    Кроме АКА, АПФ и антител к АЦЦП при РА описаны еще два представителя АФА, к которым относятся антитела к очищенному филаггрину и антитела к Sа антигену. Антитела к филаггрину могут быть выявлены с помощью метода иммуноблоттинга с использованием нативных экстрактов человеческого или животного филаггрина. Однако содержание цитруллина в антигенных экстрактах филаггрина значительно различается, что обуславливает их антигенную гетерогенность и не позволяет стандартизировать тесты для выявления АФА.

    Антиген Sа представляет собой белок с молекулярной массой 48-50 кДа, встречающийся в экстракте человеческой плаценты, а также тканях селезенки и ревматоидного паннуса. Биологическая функция Sа антигена неизвестна. Недавно было установлено, что Sа антигену соответствует цитруллин-содержащая форма виментина — компонента цитоскелета клетки. В связи с этим антитела к Sа антигену стали относить к группе антицитруллиновых антител. Антитела к Sа антигену встречаются при РА приблизительно у 40% больных. Их специфичность составляет 98%, что роднит их с АКА. Сравнительно недавно появились коммерческие наборы для обнаружения антител к цитруллинированному виментину, основанные на рекомбинантном антигене.

  • АНФ и антитела к RА-33 у больных РА [показать]

    Как и при большинстве ревматических заболеваний, в сыворотках больных РА может быть обнаружен АНФ. При РА диагностические титры отмечаются у 20-40% больных, причем встречаемость аутоантител несколько нарастает по мере увеличения длительности заболевания.

    При использовании стандартного теста для обнаружения АНФ на перевиваемой клеточной линии НЕр-2 при РА обычно отмечается мелкогранулярный или гомогенный тип свечения ядра. Клиническое значение АНФ при РА не определено. Его выявление не коррелирует с активностью и экстраартикулярными проявлениями заболевания.

    Среди преобладающих разновидностей АНА при РА отмечаются антитела к Rо/SS-А, которые выявляются в 10% наблюдений, и антитела к RА-33, антигеном которых являются белки гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (hnRNР). Данные белки входят в состав сплайсосом наряду с антигенами других рибонуклеопротеиновых АНА, в частности Sm и RNР.

    Антитела к RА-33 встречаются при РА в 30% случаев, а также отмечаются при СКВ и СЗСТ с частотой 10-15%. При СКВ и СЗСТ практически всегда они присутствуют в сочетании с антителами к U1-RNР. При других ревматических заболевания антитела к RА-33 практически не выявляются.

    В реакции непрямой иммунофлюоресценции при использовании клеток НЕр-2 они обычно характеризуются мелкогранулярным окрашиванием ядра, не отличимым от других разновидностей АНФ. Выявление АНФ не является надежным методом обнаружения данных аутоантител, так как антитела к RА-33 часто обнаруживаются в сыворотках, в которых АНФ отсутствует. Оптимальным методом их обнаружения является иммуноблоттинг, причем этот тип АНА содержится в сыворотке крови больных в невысоких титрах (1:100), однако данные антитела могут быть выявлены с помощью ИФА с использованием очищенного антигена.

    Они присутствуют в сыворотке крови приблизительно у 20% больных с серо-негативным РА вне зависимости от других серологических маркеров. Антитела к РА-33 отмечаются на этапе раннего ревматоидного артрита. Существуют данные, что они могут также встречаться до появления клинических признаков РА. При РА выявление этой разновидности АНА не зависит от длительности заболевания, возраста и пола больных, а также эффективности проводимой терапии.

    В связи с ограниченным диагностическим значением антител к RА-33, тесты, направленные на их выявление, широкого распространения в клинико-лабораторной практике не получили. Существует ряд литературных данных, что у больных с RА-33 заболевание течет менее агрессивно и характеризуется лучшим прогнозом, что позволяет использовать эти антитела в прогнозировании исхода РА.

Классификация иммунологических показателей при васкулитах

Под аутоиммунными васкулитами понимают заболевания, связанные с воспалительным процессом в сосудистой стенке, без инфекционной или токсической причины. Васкулиты подразделяют на первичные и вторичные, которые возникают на фоне другого аутоиммунного заболевания. Хотя существует ряд удобных клинических классификаций васкулитов, общепринятой является международная классификация первичных васкулитов, разработанная во время конференции в Чапелл-Хилл в 1994 году. Эта классификация дала определение 10 формам первичных васкулитов и подразделила их в соответствии с калибром поражаемых сосудов (табл. 19).

Таблица 19. Классификация васкулитов Chapel Hill Consensus Conference (Arthritis Rheum, 1994; 37:187-192) Тип васкулита Определение Васкулиты крупных сосудов Гигантоклеточный (височный) васкулит Гранулематозный заскулит аорты и ее основных ветвей с поражением ветвей наружной а. carotis. Больные >50 лет. Характерен выраженный острофазный ответ Болезнь Такаясу Гранулематозное воспаление аорты и ее основных ветвей. Больные <50 лет Васкулиты сосудов среднего калибра Узелковый полиартериит Некротизирующее воспаление артерий среднего и мелкого размера, не сопровождающееся гломерулонефритом Болезнь Кавасаки Артериит, поражающий артерии всех калибров. Характерно поражение коронарных сосудов. Чаще всего болеют дети Васкулиты мелких сосудов Гранулематоз Вегенера Гранулематозное воспаление, поражающее респираторный тракт и сопровождающееся некротическим васкулитом мелких сосудов. Характерен некротизирующий гломерулонефрит Синдром Чарга-Штраусса Богатое эозинофилами гранулематозное воспаление, поражающее респираторный тракт. Картина легочного некротизирующего васкулита, астмы и эозинофилии Микроскопический полиангиит Некротизирющий васкулит с поражением мелких сосудов. Реже признаки некротизирующего артериита с поражением мелких артерий. Некротизирующий гломерулонефрит и пульмонарный капиллярит Пурпура Шенлейна-Геноха Васкупит с отложениями IgА, поражающий мелкие сосуды. Поражает кожу, суетавы, ЖКТ и почки Эссенциальный криоглобулинемический васкулит Васкулит, сопровождающийся криоглобулинами в сыворотке. Поражения кожи и почек Кожный лейкоцитокластический васкулит Изолированный кожный ЦИК васкулит без системных и почечных проявлений

Патогенез васкулитов крупных и средних сосудов опосредован преимущественно Т-клетками, и абсолютно специфических серологических маркеров при этих заболеваниях не описано. Антиэндотелиальные антитела с различной частотой встречаются при аортоартериите Такаясу и болезни Кавасаки, а также при ряде васкулопатий, таких как гемолитико-уремический синдром, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Бехчета. Васкулиты крупных и средних сосудов сопровождаются выраженным воспалительным ответом, выявление которого представляет собой основу лабораторных методов их диагностики, наряду с морфологическим и инструментальным обследованием.

В соответствии с иммунопатогенезом васкулиты мелких сосудов могут быть подразделены на гранулематозные и иммунокомплексные. Гранулематозные васкулиты мелких сосудов, включающие синдром Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Чарга-Штраусса, имеют ряд общих черт, к которым относят поражение почек по типу олигоиммунного экстракапиллярного гломерулонефрита с полулуниями, полиневрит и легочный капиллярит.

Основным методом серологической диагностики гранулематозных васкулитов является обнаружение антинейтрофильных цитоплазматических антител (АНЦА). Антитела этого семейства реагируют с белками азурофильных гранул нейтрофильных гранулоцитов. Значение АНЦА в патогенезе и диагностике гранулематозных васкулитов позволило выделить отдельную их группу, обобщенную под названием АНЦА-ассоциированные васкулиты. К ним относятся гранулематоз Вегенера, синдром Чарга-Штраусса, микроскопический полиартериит, быстропрогрессирующий гломерулонефрит с полулуниями. К этой группе заболеваний иногда относят синдром Гудпасчера, так как АНЦА могут отмечаться у 10-15% пациентов с этим заболеванием, совместно с антителами к базальной мембране клубочка, выявление которых является основным лабораторным методом его диагностики.

Хотя синдром Гудпасчера не является системным васкулитом, он проявляется геморраггическим альвеолитом и быстропрогрессирующим гломерулонефритом, который сложно отличить от AНЦА-ассоциированного поражения почек. В связи с этим выявление АНЦА и антител к базальной мембране обычно используется совместно.

Иммунокомплексные васкулиты обусловлены образованием иммунных комплексов между аутоантителами и их антигенами в крови и сосудистой стенке. Иммунные комплексы, которые можно обнаружить в сыворотке крови называют циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК). Предполагается, что снижение растворимости ЦИК приводит к их отложению в сосудистой стенке и развитию воспаления. Снижение растворимости при замедлении скорости кровотока и температуры приводит к тому, что иммунными комплексами поражаются преимущественно капилляры и прежде всего капилляры кожи.

Криоглобулинемический васкулит сопровождается появлением в крови особой разновидности ЦИК, которая требует особых методических подходов для их обнаружения. Отдельно выделяют методы, позволяющие обнаружить отложения иммунных комплексов и комплемента непосредственно в пораженной ткани. Обнаружение отложений иммунных комплексов позволяет объективизировать иммуннокомплексный процесс и обладает большей достоверностью, по сравнению с методами выявления ЦИК.

  • Антиэндотелиальные антитела [показать]

    Антиэндотелиальные антитела (АЭА) составляют гетерогенную группу антител, направленных к антигенным детерминантам эндотелиальных клеток. Точная природа антигенов не установлена, не ясно, могут ли они представлять собой белки, конститутивно экспрессированые на поверхности эндотелиальных клеток, либо их продукция индуцируется под действием воспалительных цитокинов. Возможно, что некоторые антигены являются компонентами плазмы крови, адсорбированными на поверхности эндотелиоцита.

    АЭА были впервые обнаружены в клинике у больных СКВ при использовании метода непрямой иммунофлюоресценции на тканях лабораторных животных (Lindqvist, 1971). При СКВ частота АЭА составляет от 30 до 80%, в зависимости от используемого метода и категории больных.

    Методология выявления АЭА далека от стандартизации. Для выявления АЭА предложено множество методов, ни один из которых не может рассматриваться в качестве золотого стандарта. Основными методами являются непрямая иммунофлюоресценция на кратковременных культурах клеток эндотелия пуповины (HUVEC), а также методы ИФА и иммуноблота.

    АЭА были обнаружены при многих первичных васкулитах и васкулопатиях. Сравнительно часто их выявление связывают с болезнью Кавасаки, гранулематозными васкулитами, пурпурой Шенлейна-Геноха и вторичными васкулопатиями, в частности облитерирующим тромбангиитом (болезнь Бюргера), гемолитической тромбоцитопенической пурпурой, антифосфолипидным синдромом. Таким образом, выявление АЭА сравнительно неспецифично для определенной формы вас-кулита и рассмативается в качестве общего диагностического маркера васкулитов и васкулопатий.

    Целесообразность детекции АЭА в клинике определяется их выявлением только на фоне выраженной клинической активности заболевания, что позволяет ориентироваться на их содержание для определения фазы заболевания. Они могут играть определенную роль в патогенезе васкулитов в связи с тем, что способны модулировать экспрессию эндотелиальных молекул адгезии и факторов воспаления. АЭА, обнаруженные в сыворотке больных СКВ, способны усиливать высвобождение IL-6 из эндотелиоцитов, таким образом участвуя в патогенезе системной воспалительной реакции.

    АЭА отмечаются у большинства больных с активной формой АНЦА-ассоциированных васкулитов. У детей с пурпурой Шенлейна-Геноха наличие АЭА класса IgА коррелирует с частотой поражения почек. Показано, что АЭА служат надежным маркером активности процесса при облитерирующем тромбангиите. При синдроме Бехчета они встречаются у 50% больных, особенно у больных с выраженным кожным васкулитом.

    Васкулиты и васкулопатий на фоне системных заболеваний соединительной ткани также сопровождаются высокими титрами АЭА. У больных с СКВ при выявлении высоких титров АЭА чаще отмечаются кожные проявления васкулита и тяжелый синдром Рейно. У большинства больных с волчаночным нефритом и гипокомплементемией отмечаются высокие титры АЭА, что, по всей видимости, обусловлено способностью аутоантител непосредственно взаимодействовать с эпителиальными клетками почечного клубочка. Содержание АЭА снижается при успешной иммуносупрессивной терапии.

    Склеродермия обычно сопровождается признаками генерализованной васкулопатий. Предполагают, что одной из причин развития микроангиопатии при склеродермии могут являться АЭА, отмечающиеся у 40-60% больных. Антиэндотелиальные антитела при диффузных формах склеродермии ассоциированы с высоким риском поражения легких, характеризующегося развитием интерстициального фиброза и легочной гипертензии. У больных с АЭА часто отмечается выраженная ишемия пальцев и сосудисто-некротические изменения кожи кисти. Существует определенная связь между антифосфолипидными и антиэндотелиальными антителами. АЭА часто отмечаются у больных с АФС, невынашиванием беременности и идиопатическим ливедо. Антигены антикардиолипиновых антител, в частности комплексы фосфолипидов и бета2-ГП 1, способны связываться с поверхностью эндотелиальных клеток, что ведет к повреждению эндотелия. У женщин с повторными выкидышами в анамнезе и предполагаемым АФС также обнаруживаются АЭА. Наличие АЭА характерно для вторичных ангиопатий, в частности для диабетической микроангиопатии и сосудистого отторжения трасплантата.

    Критерии для определения АЭА в клинике окончательно не разработаны. На сегодняшний момент можно сказать, что АЭА могут служить неспецифическим маркером ангиопатий различного генеза, и мониторинг их содержания в сыворотке крови больного с течением времени позволяет установить активность патологического процесса.

  • Антинейтрофильные цитоплазматические антитела [показать]

    Впервые антитела к цитоплазме нейтрофилов были обнаружены у больного с быстропрогрессирующим гломерулонефритом (Davies, 1982). Несколько позднее, в 1985 году, Van der Woude F.J. впервые отметил АНЦА в качестве наиболее специфичного и чувствительного лабораторного маркера гранулематоза Вегенера, что привело к активному изучению этого семейства аутоантител и определению клинического значения их выявления при системных васкулитах. Было обнаружено, что в качестве антигенов АНЦА выступает ряд ферментов, содержащихся в азурофильных гранулах нейтрофилов. К известным антигенным мишеням АНЦА относятся протеиназа-3, миелопероксидаза, лактоферрин, эластаза, белок ВРI и катепсин G.

    Высокая встречаемость АНЦА при гранулематозных васкулитах ставит вопрос об их роли в патогенезе этих заболеваний. Хотя механизм индукции АНЦА остается неизвестным, доказано, что связывание антинейтрофильных антител с соответствующими мишенями на активированных гранулоцитах приводит к преждевременной дегрануляции. Это нарушает трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов из сосудистого русла и приводит к образованию воспалительной гранулемы, составляющей основу морфологической картины гранулематозных васкулитов.

    Основным методом выявления АНЦА является метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием нейтрофилов донора, фиксированных этанолом, что позволяет дифференцировать основные типы свечения аутоантител. По аналогии с выявлением АНФ, при люминесцентной микроскопии для обнаружения АНЦА можно отметить несколько типов свечения цитоплазмы клеток. Каждому из типов свечения соответствуют свои антигенные мишени. Диагностическим титром АНЦА является обнаружение антител при разведении сыворотки 1:40 и более. Учитывая, что содержание АНЦА коррелирует с активностью заболевания, в методе непрямой иммунофлюоресценции должен быть определен конечный титр. При обострении гранулематозных васкулитов обычно отмечаются титры АНЦА, превышающие 1:320. Одновременно с титром должен быть установлен тип свечения цитоплазмы клетки.

    Выделяют два основных типа свечения АНЦА - цитоплазматический и перинуклеарный (рис. 11). Цитоплазматический тип АНЦА (цАНЦА) получил название благодаря флюоресценции гранул, локализующихся в цитоплазме клетки между долями ядра лейкоцита. При выявлении перинуклеарного типа свечения (пАНЦА) свечение как бы очерчивает доли ядра лейкоцита, оставляя неокрашенным ядро клетки. Обнаружение пАНЦА представляет собой последствие фиксации нейтрофилов этанолом, которая ведет к прераспределению гранул в цитоплазме клетки, в результате чего положительно заряженные антигены гранул притягиваются отрицательно заряженной ДНК ядра. Похожее свечение обнаруживается в присутствии АНА, прежде всего антител к дсДНК и гистоновым белкам. Нейтрофилы обладают большинством антигенов антинуклеарных антител, и являются субстратом для обнаружения

    Для того чтобы отличить АНФ от специфического свечения АНЦА, необходимо параллельно тестировать все сыворотки, положительные по антинейтрофильным антителам в отношении АНФ, что обеспечивает большую специфичность выявления антинейтрофильных аутоантител. Кроме двух основных типов свечения, может быть отмечен ряд атипичных вариантов окрашивания клетки, которые обобщают как хАНЦА. Выявление атипичных вариантов свечения АНЦА используется в диагностике воспалительных заболеваний кишечника. Атипичные варианты АНЦА описаны при язвенном колите (70%), болезни Крона (10%), аутоиммунном гепатите (50%), первичном склерозирующем холангите (40%), первичном билиарном циррозе (5%) и васкулитах при ревматоидном артрите (5-10%).

    Антигенная специфичность АНЦА может быть установлена не во всех сыворотках, содержащих антинейтрофильные антитела, обнаруженные с помощью непрямой иммунофлюоресценции. В соответствии с рекомендациями интернационального консенсуса (Savige, 1999) целесообразно определение специфичности АНЦА только после определения аутоантител с помощью непрямой иммунофлюоресценции, что обеспечивает максимальную чувствительность выявления антинейтрофильных антител (табл. 20).

    Таблица 20. Антигенная специфичность основных типов АНЦА и приблизительная частота их обнаружения цАНЦА Протеиназа-3 90% Миелопероксидаза 5% Белок ВРI 4% пАНЦА Миелопероксидаза 70% Лактоферрин 10% Эластаза 8% Катепсин G 5% Протеиназа-3 2% хАНЦА Лактоферрин 10% Эластаза 10% Неуточненные антигены

    При цАНЦА типе свечения в большинстве случаев могут быть обнаружены антитела против протеиназы-3 (ПР-3). ПР-3 представляет собой сериновую протеиназу массой 29 кДа, которая локализуется в азурофильных гранулах нейтрофила наряду с другими сериновыми протеиназами. Редко при выявлении цАНЦА типа свечения отмечаются антитела к другим ферментам гранул, прежде всего белку ВРI. Наличие цАНЦА/анти-ПР3 антитела являются основной разновидностью антинейтрофильных антител в сыворотке больных гранулематозом Вегенера. При этом заболевании титр цАНЦА связан с клинической активностью процесса и успешная иммуносупрессивная терапия гранулематоза приводит к снижению содержания антител ниже порога детекции.

    Большая часть сывороток, индуцирующих перинуклеарный тип иммунофлюоресценции, реагирует с миелопероксидазой (МПО) - основным микробицидным ферментом азурофильных гранул, генерирующим кислородные радикалы. Миелопероксидаза обладает выраженным положительным зарядом, что обуславливает ее перераспределение к ядру при фиксации нейтрофилов этанолом. Кроме того, при перинуклеарном типе флюоресценции часто отмечаются АНЦА, направленные к другим ферментам нейтрофильных гранул, таким как лактоферрин, эластаза и каптепсин G.

    Антитела к МПО были впервые описаны у больных с идиопатическим быстропрогрессирующим олигоиммунным гломерулонефритом с полулуниями, который представляет собой клиническую разновидность микроскопического полиангиита (Falk R.J. и Jennette J.C., 1988). В отличие от антител к ПР-3, пАНЦА/анти-МПО не обладают высокой специфичностью для диагностики какого-либо конкретного васкулита и выявляются при всех АНЦА-ассоциированных васкулитах и родственных им заболеваниях. Антитела к МПО встречаются у большинства больных идиопатическим некротизирующим васкулитом с полулуниями, микроскопическим полиангиитом, а также при ГВ без антител против ПР-3/цАНЦА.

    Существует несколько работ о встречаемости пАНЦА при СКВ, однако вопрос об их значении при этом заболевании не решен окончательно. При СКВ, благодаря высокой аффинности ДНК к МПО, циркулирующие в крови рибонуклеиновые кислоты из разрушенных клеток способны связываться с МПО-субстратом в иммуноферментных тестах для определения пАНЦА, что приводит к высокой частоте ложноположительных результатов.

    Минорные разновидности антител, направленных к другим белкам нейтрофильных гранул, встречаются значительно реже, и значение их выявления в иммунологической диагностике установлено лишь частично.

    Антинейтрофильные антитела к ВРI (bactericidal permeability increasing protein) выявляются у 60% пациентов с муковисцидозом и при иммунофлюоресценции ведут к цАНЦА типу свечения. В качестве основного индуктора антител к ВРI рассматривают псевдомонадную инфекцию, которая часто сопутствует муковисцидозу.

    Антитела к лактоферрину и катепсину G отмечаются при васкулитах на фоне ревматоидного артрита, СКВ и васкулитах при хроническом гранулематозном воспалении при воспалительных заболеваниях кишечника. Высокая встречаемость антител к лактоферрину наблюдается у больных с аутоиммунными заболеваниями печени, такими как аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз. АНЦА, которые встречаются у 30-40% больных с первичным склерозирующим холангитом, обусловлены присутствием антител к лактоферрину. Антитела к нейтрофильной эластазе отмечаются при СКВ, особенно при неврологических проявлениях этого заболевания, а также они отмечаются при ревматоидном артрите и у больных с неспецифическим язвенным колитом.

  • Антитела к базальной мембране клубочка [показать]

    Синдром Гудпасчера является крайне редким аутоиммунным заболеванием, популяционная частота которого составляет 0,5-1,0 на 1 000 000 населения. Существует два возрастных пика развития быстропрогрессирующего гломерулонефрита - на третьей и седьмой декаде. Синдром Гудпасчера с одинаковой частотой поражает женщин и мужчин, однако поражения легких чаще отмечаются у лиц мужского пола. Наличие высокоспецифических серологических маркеров, коими являются антитела к базальной мембране клубочка, позволят диагностировать это редкое, но очень опасное аутоиммунное заболевание.

    Антитела к базальной мембране клубочка направлены против неколлагенового участка альфа-3-цепи коллагена IV типа — антигена, который может быть обнаружен в почках, легких, хрусталике, улитке, мозге и яичках. Коллаген IV типа является основным компонентом базальных мембран альвеол и клубочка почки, что обуславливает специфическую клиническую картину синдрома Гудпасчера, сочетающую гломерулонефрит и геморрагический альвеолит. Поражение почек обычно преобладает в клинической картине, что позволяет выделять лимитированную форму синдрома Гудпасчера, сопровождающуюся развитием быстропрогрессирующего гломерулонефрита.

    Антитела к базальной мембране непосредственно участвуют в патогенезе поражения почек при этом заболевании, их введение лабораторному животному приводит к развитию экстракапиллярного гломерулонефрита. Высокие титры антител к базальной мембране могут быть обнаружены в элюатах из почек, а их содержание в сыворотке коррелирует с клинической активностью заболевания. При иммунофлюоресцентном исследовании биопсий почек при синдроме Гудпасчера аутоантитела могут быть обнаружены в виде линейных отложений иммуноглобулинов на базальной мембране клубочков.

    Основным методом выявления антител к базальной мембране является ИФА c использованием очищенного антигена. Выявление антител является диагностическим для этого заболевания и позволяет осуществлять дифференциальную диагностику с другими причинами легочных кровотечений и гломерулонефрита.

    Раннее обследование больных с синдромом Гудпасчера является крайне важным для прогноза больных с этим заболеванием, так как только назначение специфической терапии позволит сохранить функцию почек, а зачастую и предотвратить гибель больного. Высокие титры антител к базальной мембране могут сохраняться на этапе клинической ремиссии и постепенно снижаются через несколько месяцев. Пересадка почки может быть рекомендована только у серонегативных пациентов, так как при сохранении значимых титров антител к базальной мембране сохраняется высокий риск рецидива заболевания в трансплантате. Антитела к базальной мембране почки и АНЦА могут сочетаться у пациентов с быстропрогрессирущим гломерулонефритом и системными васкулитами. Антитела к базальной мембране клубочка чаще сочетаются с антителами к МПО.

  • Циркулирующие иммунные комплексы [показать]

    Кожа, благодаря ее обильной васкуляризации и мелкому калибру сосудов, поражается, прежде всего, иммунокомплексными, лейкоцитокластическими васкулитами, получившими название васкулитов гиперчувствительности (Zeek, 1948). Основными морфологическими признаками лейкоцитокластического васкулита являются фибриноидный некроз стенок сосуда с инфильтрацией полиморфноядерными нейтрофилами, некоторые из которых разрушаются с образованием характерного ядерного дебриса. Разновидностью лейкоцитокластических васкулитов является их лимфоцитокластический вариант, при котором преобладает лимфоцитарная инфильтрация.

    Обычно лейкоцитокластический васкулит развивается на фоне другого аутоиммунного заболевания или представляет собой реакцию гиперчувствительности в отношении экзогенного агента. Все эти состояния характеризуются появлением в сыворотке крови больного ЦИК, оседающих на стенках мелких сосудах. Образование иммунных комплексов является частью нормальных процессов взаимодействия антитела с антигеном. Появление экзогенного антигена в крови и гуморальный иммунный ответ являются основной причиной формирования ЦИК.

    В то же время иммунные комплексы могут состоять исключительно из иммуноглобулинов, например при криоглобулинемиях и болезни Шенлейна-Геноха, что может быть обусловлено нарушением синтеза антител при этих заболеваниях. Связывание экзогенного антигена со специфическими антителами приводит к образованию иммунных комплексов, которые могут захватываться рецепторами к Fс-фрагментам молекул иммуноглобулинов и к комплементу на клетках ретикуло-эндотелиальной системы, обеспечивающих клиренс иммунных комплексов.

    Иммунокомплексный васкулит может быть следствием образования избыточного количества ЦИК, нарушением нормального клиренса ЦИК, а также сниженной растворимости образующихся иммунных комплексов. В результате ЦИК откладываются в стенке мелких сосудов, что приводит к активации комплемента, синтезу анафилотоксинов и цитокинов и последующему развитию лейкоцитарного инфильтрата.

    Существует множество лабораторных тестов, направленных на обнаружение ЦИК (табл. 21), но оптимального лабораторного теста для обнаружения ЦИК не существует. Это связано с полиморфизмом иммунных комплексов, состав, масса и заряд которых очень не постоянны.

    Таблица 21. Методы выявления циркулирующих иммунных комплексов Основа метода Тест Физико-химические свойства Криопреципитация Преципитация полиэтиленгликолем Ультрацентрифугирование Морфология и размер Непрямой фагоцитоз гранулоцитами Связывание комплемента Связывание С1q Связывание конглютинина Антикомплементарная активность Связывание с антиглобулином Ингибирование активности РФ Связывание с рецепторами клеток (через Fc) Активация тромбоцитов Связывание рецепторами клеток (через Fc и рецептор комплемента) Тест на клетках Raji

    Кроме того, стандартизация ряда биологических тестов затруднена, в связи с чем чаще используются менее информативные физико-химические и биохимические методы. Хотя выявление ЦИК признано полезным, дополнительным лабораторным параметром при СКВ и ревматоидном артрите, использование конкретных тестов затруднено их плохой воспроизводимостью, трудоемкостью и низкой специфичностью.

    В нашей стране в подавляющем числе лабораторий используется осаждение ЦИК с помощью полиэтиленгликоля. Это грубый тест, позволяющий установить присутствие в сыворотке молекулярных комплексов большой молекулярной массы. Наилучшим тестом для обнаружения ЦИК является реакция связывания С1q фактора комплемента, применяемая в большинстве клинических исследований, анализирующих появление ЦИК в сыворотке.

    Недостаточная надежность методов определения ЦИК в сыворотке крови приводит к определенному скепсису и отказу от их использования. Это связано с непостоянством выявления и, зачастую, с отсутствием значимых концентраций ЦИК, даже при наличии морфологических и клинических доказательств иммунокомплексного повреждения ткани. Кроме того, высокое содержание ЦИК может обнаруживаться у клинически здоровых людей.

    Тем не менее наблюдение за динамикой содержания ЦИК может быть использовано при оценке клинической активности иммунокомплексных заболеваний, вследствие чего должно выполняться проспективно, наряду с определением других иммунологических показателей. При СКВ и РА содержание ЦИК достоверно коррелирует с активностью процесса и может применяться с целью мониторинга состояния пациента. Одновременно с содержанием ЦИК необходимо выполнять тесты, оценивающие систему комплемента, такие как СН50, С3 и С4. Потребление комплемента наряду с увеличением содержания ЦИК служит признаком текущей активности иммунокомплексного васкулита и требует принятия активных мер.

    Альтернативой выявления содержания ЦИК в сыворотке крови является морфологическое исследование биопсий ткани с помощью прямой иммунофлюоресценции для обнаружения отложений иммуноглобулинов и факторов комплемента. Таким образом, если в развитии заболевания подозревается иммуннокомплексный процесс, то следует рекомендовать биопсию ткани с прямым иммунофлюоресцентным исследованием, которое подтверждает отложение иммунных комплексов в пораженной ткани.

  • Криоглобулины [показать]

    Выявление криоглобулинов стоит особняком среди других методов обнаружения ЦИК, так как является надежным методом диагностики криоглобулинемий, проявляющихся развитием иммунокомплексного васкулита.

    Криоглобулины представляют собой ЦИК, состоящие исключительно из иммуноглобулинов и способные образовывать нерастворимые конъюгаты при температурах ниже температуры ядра человеческого тела. Их преципитация в мелких сосудах кожи приводит к клинике криоглобулинемий, характеризующейся геморрагическим васкулитом на конечностях, слабостью и артралгиями. Реже при криоглобулинемиях наблюдается гломерулонефрит, лимфаденопатия и спленомегалия, периферическая нейропатия и синдром Рейно. Наиболее часто этот вид патологии встречается у 40-50-летних людей, причем женщины заболевают в 3 раза чаще мужчин.

    Определение криоглобулинов должно проводиться в сыворотке, а не в плазме, чтобы избежать возможной ошибки при обнаружении криофибриногена, особого типа фибриногена, коагулирующего при низких температурах. Кровь должна быть получена от больного непосредственно в лаборатории для того, чтобы не допустить ее охлаждения, образования кровяного сгустка, и центрифугирование осуществляется при температуре 37°С. Для обнаружения выпавшего криопреципитата в сыворотке крови требуется более 48 часов. Преципитация криоглобулинов 3 типа может занять до 5 дней.

    Поскольку даже нормальная сыворотка способна за такое время образовывать нерастворимые преципитаты, то после обнаружения криопреципитата необходимо достичь его растворения путем повторного нагревания до 37°С. Результат преципитации криоглобулинов не всегда очевиден. Агрегация криоглобулинов может происходить с образованием кристаллов белка, хлопьев, геля. Для унификации содержания криоглобулинов после образования осадка, преципитат необходимо отцентрифугировать в стандартных условиях, что позволяет полуколичественно оценить объем криоглобулинов в виде криокрита. Оценка криокрита может быть использована при контроле за эффективностью терапии криоглобулинемии.

    Выделяют 3 типа криоглобулинемии.

    Криоглобулины первого типа характеризуются присутствием в плазме моноклинального иммуноглобулина, обычно IgМ или IgG. Основными причинами его возникновения являются лимфопролиферативные заболевания, прежде всего миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, хронический лимфоцитарный лейкоз и различные формы лимфом. Криоглобулины выявляются у 40% больных с миеломой, однако только у половины больных с криоглобулинемией первого типа отмечаются клинические проявления, связанные, прежде всего, с увеличением вязкости крови, такие как головные боли, нарушения зрения, геморрагии сосудов сетчатки и синдром Рейно.

    При втором типе отмечаются Криоглобулины смешанного состава, включающие в себя моноклональный компонент, обычно РФ класса IgМ, и поликлональный IgG. Этот тип криоглобулинемии часто встречается изолированно, представляя собой эссенциальную (смешанную) криоглобулинемию. Реже смешанная криоглобулинемия является вторичной находкой у больных с вирусными инфекциями, заболеваниями соединительной ткани, лимфопролиферативными процессами и скрытыми инфекциями. Основным инфекционным агентом, приводящим к развитию смешанной криоглобулинемии, является вирус гепатита С. В соответствии с нашими данными, основанными на обследовании 116 больных с вирусным гепатитом С с экстрапеченочными проявлениями, значимые титры криоглобулинов могут быть обнаружены у 42% больных, у подавляющего большинства из них в сыворотке также отмечаются диагностические титры РФ. Криоглобулины отмечались преимущественно у больных с цирротической стадией вирусного гепатита. У 50% с криоглобулинемией отмечались клинические признаки геморрагического васкулита, у 10% больных отмечался мочевой синдром. Таким образом, смешанная криоглобулинемия характеризуется тяжелыми клиническими проявлениями, напоминающими системный заскулит с триадой, сочетающей разнообразные поражения кожи — от пурпуры до геморрагического некроза, боли в суставах и гломерулонефрит, встречающийся у 50% больных с криокритом, превышающим 3%.

    Криоглобулинемия третьего типа является наиболее часто встречающейся разновидностью данной патологии и представлена смешанными иммунными комплексами поликлональных криоглобулинов, в составе которых обычно отмечается поликлональный ревматоидный фактор класса IgМ. Третий тип встречается у больных с ДБСТ, в частности СКВ, РА, СШ, аутоиммунными заболеваниями ЖКТ, постстрептококковым гломерулонефритом, подострым бактериальным эндокардитом, цитомегаловирусными инфекциями, инфекционным мононуклеозом. Особенно часто он отмечается у больных с хроническими вирусными гепатитами, и картина васкулита, сопровождающаяся обнаружением криоглобулинов третьего типа, может явиться первым проявлением этого заболевания.

  • Выявление отложений иммунных комплексов в биоптатах кожи и "тест волчаночной полоски" [показать]

    Прямая иммунофлюоресценция позволяет выявлять отложения иммунных комплексов в ткани органов-мишеней. В диагностических целях наиболее часто используются биопсия почек и/или биопсия кожи. Исследование биоптатов тканей имеет четкое диагностическое значение и, зачастую, представляет единственный метод подтверждения диагноза при неоднозначной клинической и серологической картине заболевания. При прямом иммунофлюоресцентном исследовании биоптатов кожи больных ДБСТ наблюдаются три основных типа отложений иммуноглобулинов и комплемента: АНА in vivo, волчаночная полоска и отложения в стенках сосудов дермы.

    Феномен обнаружения АНА, фиксированных непосредственно в ткани, обозначается как "антинуклеарные антитела in vivo". In vivo АНА, обычно представленные иммуноглобулинами класса IgG, окрашивают ядра клеток эпидермиса кожи. Предполагается, что этот феномен характерен для всех системных аутоиммунных заболеваний, сопровождающихся АНА. Тем не менее, относительно постоянно он встречается только при СКВ и СС.

    В основе этого АНА in vivo лежит способность проникновения аутоантител в живую клетку, что характерно именно для рибонуклеопротеиновых аутоантител. По аналогии с выявлением АНФ может быть исследован тип флюоресценции. Тип флюоресценции дает дополнительные сведения: гранулярный тип свечения отмечается при всех аутоиммунных заболеваниях, нуклеолярный тип свечения отмечается только при склеродермии, а гомогенный тип свечения наблюдается преимущественно при СКВ. Обнаружение АНА в эпидермисе обычно связано с присутствием антител к рибонуклеопротеинам, но не антител к дсДНК. При синдроме Шогрена характерный тип нуклеарных/цитоплазматических депозитов IgG сопровождается наличием аутоантител к Rо/SS-А и Lа/SS-В. Несмотря на то, что выявление АНА в ткани иногда позволяет заподозрить СКВ, особенно при исследовании материала биопсий почек, встречаемость этого феномена очень низка и не превышает 10% при анализе биоптатов кожи.

    Другим крайне характерным и постоянным признаком, который может быть обнаружен при иммунофлюоресцентном исследовании биоптатов кожи, являются крупногранулярные отложения иммуноглобулинов и комплемента под базальной мембраной эпидермиса. Обнаружение этого феномена в биоптатах клинически здоровой кожи больных СКВ носит название "тест волчаночной полоски" (ТВП) (lupus band test, англ.) и отмечается только при СКВ. Благодаря частой встречаемости и высокой специфичности ТВП, метод прямого иммунофлюоресцентного исследования биоптатов кожи при СКВ должен широко использоваться для диагностики этого заболевания.

    ТВП представляет собой накопление иммунных комплексов in situ. Апоптоз кератиноцитов при СКВ рассматривается в качестве источника иммуногенного апоптотического материала, вызывающего гуморальный иммунный ответ. Апоптотические тельца, которые образуются при разрушении базальных слоев кератиноцитов, через базальную мембрану эпителия поступают в дерму, где они связываются с аутоантителами, циркулирующими в крови. При окрашивании ткани антисывороткой к иммуноглобулинам и факторам комплемента, меченной флюоресцентной меткой, при микроскопии выявляется яркая прослойка крупных гранул иммунных комплексов (рис. 13).

    Набор иммуноглобулинов в составе ТВП варьирует, более часто отмечаются отложения IgМ, реже отмечаются IgG и IgА. Факторы комплемента, прежде всего С3, отмечаются наряду с отложениями IgМ. Выраженность ТВП не постоянна и неоднородна на разных участках кожи. Частота выявления положительного ТВП выше при биопсии кожи открытых участков тела, подвергающихся действию солнечных лучей, таких как предплечье, плечо и грудь. При биопсии рекомендуется выбирать участки неизмененной кожи, так как воспаление и рубцевание затрудняют описание ТВП.

    ТВП чаще отмечается у больных с СКВ, и его чувствительность достигает 98% в диагностике тяжелых системных форм этого заболевания. Выраженность депозитов IgG коррелирует с общей тяжестью заболевания, титром антител к дсДНК и поражением почек. При дискоидной волчанке и формах СКВ с преимущественным поражением кожи частота ТВП ниже и составляет 50-60%, однако превышает частоту обнаружения АНФ при дискоидной волчанке.

    Морфологическая достоверность, легкость получения материала и высокая специфичность этого метода делает его очень привлекательным для клинического использования. В нашей практике выявление ТВП является надежным диагностическим методом диагностики системных форм красной волчанки. При диагностике ДКВ ТВП оказался даже более чувствительным, по сравнению с обнаружением АНФ. В 70% случаев основным иммуноглобулином, который составляет ТВП, является IgМ, реже выявляются IgG и IgА. Отложения факторов комплемента С3 и С1q встречаются непостоянно.

    Выявление ТВП в редких случаях следует отличать от специфических отложений IgА при дерматите Дюринга. Герпетиформный дерматит Дюринга представляет собой разновидность буллезных дерматозов и отмечается преимущественно у пациентов с целиакией. При этом заболевании отмечаются гранулярные отложения IgА под базальной мембраной эпидермиса, располагающиеся на вершине сосочков дермы.

    При исследовании биоптатов кожи при ревматических заболеваниях могут быть обнаружены гранулярные отложения иммуноглобулинов в стенках сосудов, которые могут быть обнаружены как в поверхностных, так и в глубоких сосудах. Отложения иммуноглобулинов и факторов комплемента в сосудах дермы отмечаются при пурпуре Шенлейна-Геноха, герпетиформном дерматите Дюринга, лейкоцито-кластическом и криоглобулинемическом васкулите, СКВ и дерматомиозите. При пурпуре Шенлейна-Геноха выраженные гранулярные отложения в стенках сосудов представлены IgА. Частота их обнаружения выше в период обострения заболевания, выраженность отложений в сосудах кожи коррелирует с тяжестью поражения почек при этом заболевании. При иммунокомплексных васкулитах, в том числе при эссенциальной криоглобулинемии и СКВ, в сосудах кожи отмечаются отложения иммуноглобулинов всех классов. При СКВ отложения иммуноглобулинов крупнее и более выражены.

    При дерматомиозите метод прямой иммунофлюоресценции позволяет обнаружить отложения мембраноатакующего комплекса (МАК) комплемента, представленного отложениями терминальных компонентов системы комплемента (С5b-9) в микроциркуляторном русле кожи. По диагностической значимости МАК в капиллярах кожи под базальной мембраной может сравниться с ТВП при СКВ, обладая специфичностью, достигающей 90% при сопоставимой чувствительности. Сходные отложения МАК при дерматомиозите могут быть обнаружены в сосудах склетных мышц.

    Гистологическая картина поражения мышечной ткани при ДМ характеризуется выраженным васкулитом с периваскулярными инфильтратами, состоящими из СD4+ лимфоцитов. Некроз миоцитов происходит по периферии мышечных волокон и возникает на фоне поражения сосудов. Отложения МАК характерны для зон с сохраненной гистологической структурой мышечной ткани, в которой протекает активный воспалительный процесс. В районах тотального фиброза мышцы отложения МАК не выявляются. По всей видимости, разрушение капилляров под действием факторов комплемента приводит к склерозированию и разрушению мышечной ткани. Причиной образования МАК при дерматомиозите в сосудах кожи и мышц могут являться комплементсвязывающие антиэндотелиальные антитела, которые могут быть обнаружены у 50% больных дерматомиозитом. Образование МАК при связывании антиэндотелиальных антител с антигенами ведет к развитию васкулита в сосудах кожи и мышц.

  • Другие иммунологические показатели при васкулитах [показать]

    Кроме АЭА, в качестве неспецифического маркера васкулитов разной этиологии применяются исследования факторов, продуцируемых поврежденной клеточной стенкой в ответ на иммунное поражение. С этой целью используется мониторирование содержания VIII фактора (ф. Виллебранда), тромбомодулина и фибронектина, сывороточных белков, синтезируемых эндотелиоцитами в ответ на повреждение. Практически у всех больных с активными формами васкулитов отмечаются повышенные уровни этих маркеров, что позволяет использовать их с диагностической целью. Более того, нарастание их содержания в плазме крови свидетельствует об активности васкулита.

    Содержание фактора фон Виллебранда отражает непосредственное повреждение эндотелиальных клеток. Однако результаты его определения у больных с васкулитами оказались неопределенными. Показано, что высокие уровни отмечаются при активном заболевании и могут сохраняться, несмотря на клиническое улучшение. Последующие эксперименты in vitro показали, что фактор высвобождается как поврежденными, так и интенсивно делящимися эндотелиоцитами. Это в какой-то степени объясняет неоднозначные клинические результаты.

    Фибронектин представляет собой высокомолекулярный гликопротеин матрикса соединительной ткани, включающийся в состав иммунных комплексов и участвующий в их клиренсе. Его высокое содержание обнаруживается при васкулитах, связанных с РА, СКВ, синдроме Кавасаки, васкулите при синдроме Бехчета, и отражает разрушение сосудистой стенки. Содержание фибронектина плазмы снижено при эссенциальной смешанной криоглобулинемии, что отражает его связывание в составе криоглобулинов.

    Тромбомодулин является мембранным гликопротеином эндотелиоцита, и его выделение в кровоток сопутствует повреждению сосудистой стенки. В качестве маркера активности СКВ тромбомодулин превосходит растворимые молекулы адгезии, sIL2R, сывороточные IL-6, IL-10, антитела к дсДНК, острофазовые белки, СОЭ, комплемент и иммуноглобулины, креатинин и антинуклеарные антитела. Его высокое содержание в плазме крови отмечается при пурпуре Шенлейна-Геноха, СЧШ и других АНЦА-ассоциированных васкулитах.

    Другим продуктом эндотелиальных клеток являются растворимые формы адгезионных молекул. Они выделяются при активации эндотелиальных клеток при воспалении и потенциально могут использоваться в качестве показателей активности васкулитов и близких васкулитам состояниях. IСАМ-1 — одна из основных межклеточных молекул адгезии, осуществляющая взаимодействие лейкоцитов и эндотелиоцитов. Ее экспрессия на мембране эндотелиоцита индуцируется при воспалении. Кроме того, при активации клетки происходит слущивание этих молекул с мембран клеток, приводящее к образованию растворимой формы sIСАМ-1. Увеличенные уровни sICАМ-1 в сыворотке наблюдаются при височном заскулите, пурпуре Шенлейна-Геноха, АНЦА-ассоциированных и лейкоцитокластических васкулитах, активной СКВ, синдроме Бехчета, септическом шоке, злокачественных новообразованиях и инфаркте миокарда. Васкулит, сопровождающий системные заболевания соединительной ткани, также приводит к увеличению содержания sIСАМ-1. У больных РА отмечается значительно увеличенное содержание sICАМ-1 в сыворотке крови, причем особенно высокие концентрации sIСАМ-1 наблюдались у больных с клиникой иммунокомплексного васкулита.

    С той же целью используется определение растворимых форм других эндотелиальных молекул адгезии sVСАМ и L-селектина. Несмотря на разнообразие данных об их клиническом значении, их место в диагностике васкулитов на настоящий момент окончательно не определено.

Тесты для оценки иммунного воспаления
Иммуноглобулины и их подклассы при ревматических заболеваниях

Общее содержание иммуноглобулинов нередко повышено при ДБСТ, достигая максимальных концентраций при СКВ, СШ и эссенциальной криоглобулинемии. В основе этого процесса лежит гиперстимуляция гуморального звена иммунитета. Предполагается, что в основе поликлональной подукции иммуноглобулинов при аутоиммунных заболеваниях лежит повышение экспрессии СD40L молекул на Т-лимфоцитах, стимулирующих СD40 рецепторы на В-клетках, а также увеличенное содержание IL-10 в сыворотке крови у этих больных, которое тесно коррелирует с содержанием иммуноглобулинов сыворотки. Те же патогенетические механизмы участвуют в развитии гипергаммаглобулинемии при аутоиммунном гепатите и ВИЧ-1 инфекции.

Гипергаммаглобулинемическая пурпура отмечается при заболеваниях, приводящих к значительному увеличению содержания иммуноглобулинов в крови. Рецидивирующая пурпура типична для СШ, сопровождающегося высокими уровнями гаммаглобулинов и IgG, ЦИК, присутствием высоких титров РФ, антител к Rо/SS-А и Lа/SS-В, АНА. При гистологическом исследовании биоптатов кожи при гипергамма-глобулинемической пурпуре выявляется лейкоцитокластический нейтрофилыный васкулит и отложения ммуноглобулинов в стенках сосудов кожи. Криоглобулины также являются частой находкой в сыворотках больных с СШ. Анализ криоглобулинов, обнаруживающихся у 50% больных СШ с признаками иммунокомплексного васкулита, показал, что они преимущественно состоят из иммуноглобулинов смешанного типа, содержащего преимущественно моноклональный РФ. Таким образом, больные СШ с экстрагландулярными проявлениями имеют больший риск развития лимфопролиферации. Это подтверждается иммуно-гистохимическими исследованиями, подтверждающими пролиферацию В-клеток, секретирующих моноклональный IgМ.

В исследованной нами группе 10 больных СШ, подтвержденном по результатам офтальмологического обследования, встречаемость как РФ, так и АНФ составила 90%. Криоглобулины были обнаружены у 2 пациентов с признаками геморрагического васкулита.

Синтез широкого спектра аутоантител при СШ приводит к развитию иммунокомплексных васкулитов. К ним относятся классический иммунокомплексный васкулит, обусловленный высоким содержанием ЦИК в сыворотке, гипергаммаглобулинемический васкулит, отражающий В-клеточную активацию и криоглобулинемический васкулит, связанный с образованием РФ-содержащих криоглобулинов в сыворотке крови.

При СШ выделяется 2 типа воспалительной васкулопатии, делящейся по характеру инфильтрата на нейтрофильную и мононуклеарную. Нейтрофильный тип сопровождается гипергаммаглобулинемией, гипокомплементемией, высокими титрами РФ, АНА и антител к Rо/SS-А, и отмечается у пациентов с более агрессивным аутоиммунным процессом.

Одним из подходов к изучению иммунного ответа является определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови и биологических жидкостях, а также выявление антигенспецифического иммунного ответа, обусловленного иммуноглобулинами разных классов и подклассов. Это позволяет проанализировать ряд свойств иммунного ответа при конкретном заболевании. Антитела, представленные IgМ, отражают первичный иммунный ответ на антиген. Увеличение содержания антиген-специфичных антител класса IgМ с одновременным падением титра специфического IgG нередко свидетельствует о снижении активности аутоиммунного процесса, например при АФС. IgА является основным секреторным иммуноглобулином, повышенное содержание которого отмечается при пурпуре Шенлейна-Геноха, анкилозирующем спондилите, болезни Кавасаки, аутоиммунном гепатите, IgА-нефропатии, целиакии, и, вероятно, отражает антигенную стимуляцию слизистых.

Антитела класса IgЕ, участвующие в патогенезе аллергических реакций, нередко встречаются при ревматических заболеваниях. При болезни Кавасаки и синдроме Чарга-Штраусса IgЕ входит в состав ЦИК, которые могут быть осаждены полиэтиленгликолем, что не характерно для классических аллергических заболеваний. ЦИК, содержащие IgЕ, способны активировать комплемент по альтернативному пути, таким образом участвуя в развитии васкулита.

Иммуноглобулин G — преобладающий класс иммуноглобулинов сыворотки крови, определяющий качество и интенсивность вторичного иммунного ответа на антиген. Именно иммуноглобулином этого класса представлены антиген-специфические антитела, встречающиеся при большинстве аутоиммунных заболеваний. Широкое распространение получило определение антител, обусловленных подклассами IgС.

Антитела подклассов IgG1 и IgGЗ направлены преимущественно против белковых антигенов, причем IgGЗ антитела обладают большим сродством к антигену по сравнению с IgG1. Их синтез обусловлен стимуляцией В-клеток Тh2 лимфоцитами. Высокое содержание аллерген-специфического IgG4 (наряду с IgЕ и IgG1) описано при бронхиальной астме, атопическом дерматите, пищевых аллергиях, гипер-IgЕ синдроме. В свою очередь, IgG2 взаимодействует с полисахаридными антигенами, регуляция его синтеза контролируется интерфероном-гамма.

Таким образом, содержание IgG2 может служить косвенным маркером активации Тh1 лимфоцитов и цитотоксического иммунного ответа, позволяя судить об активности отдельных звеньев иммунной системы.

Иммуноглобулиновый ответ при системных заболеваниях соединительной ткани обусловлен преимущественно Тh2-зависимыми субклассами IgG, такими как IgG1/ IgGЗ и IgG4. Иммунный ответ на различные антигены может осуществляться определенным классом иммуноглобулинов. Так, при СКВ и СШ антитела к Rо/SS-А обусловлены исключительно IgG1. При СКВ антитела к дсДНК представлены IgG1/IgGЗ. Почти для всех системных заболеваний соединительной ткани типично снижение содержания IgG2 и подавляющее большинство аутоантител обусловлено другими подклассами IgG. Тем не менее, антитела к кардиолипину и антитела к U1-RNP преимущественно представлены IgG2.

Литературные данные, касающиеся субклассов IgG при АНЦА-ассоциированных васкулитах, противоречивы. Антитела к ПР-3 представлены IgGЗ, увеличение титра аутоантител именно этого класса предшествует обострению ГВ. Среди антител к МРО отмечается сравнительно высокое содержание IgG2, наряду с IgG1/IgG3. В ряде исследований было обнаружено увеличение содержания IgGЗ антител при обострении васкулита и, наоборот, снижение активности процесса коррелировало с повышением содержания IgG2 АНЦА в сыворотке.

При неспецифическом язвенном колите преобладают антитела IgG1, а также IgGЗ и IgG4, в то время как при болезни Крона и целиакии преобладающим классом иммуноглобулинов является IgG2. Обращает на себя внимание тот факт, что при гломерулонефритах в клубочках встречаются преимущественно отложения IgGЗ и практически отсутствуют отложения IgG2.

Значение и клиническая роль иммуноглобулин-специфических иммунных ответов при ревматологических заболеваниях окончательно не установлена. Тем не менее, обобщение накопленных данных позволяет надеяться на большие клинические перспективы определения классов иммунноглобулинов и их подклассов, которыми представлены аутоантитела.

  • Система комплемента [показать]

    Система комплемента является интегральной частью иммунной системы. Она состоит из группы сывороточных белков, которые потенциируют гуморальную фазу воспаления и защищают организм от инфекций. Комплемент может способствовать клиренсу иммунных комплексов и мертвых клеток. С другой стороны, аутоагрессивные свойства активированных факторов системы комплемента могут проявляться в анафилактических реакциях (СЗа, С5а) и цитотоксических реакциях. С диагностической точки зрения, интерес представляют два основных пути активации мембраноатакующего комплекса - классический и альтернативный. Первый связан с факторами комплемента С1q, С2, С4, а второй - с системой пропердина и фактором В. Фактор СЗ служит основой мембраноатакующего комплекса и является участником конечного путь активации комплемента.

    В клинике применяются как функциональные тесты, позволяющие судить о состоянии системы комплемента в целом, так и прямое измерение содержания конкретных факторов комплемента в сыворотке крови.

    Среди функциональных тестов наиболее часто используемым является исследование общей гемолитической активности сыворотки (СН-50). Этот тест оценивает наличие в сыворотке факторов системы комплемента, достаточных для достижения 50% гемолиза стандартного количества сенсибилизированных эритроцитов барана. Данное исследование является чувствительным и воспроизводимым тестом для выявления генетических дефектов системы комплемента у больных с повторяющимися инфекциями и наследственными формами иммунодефицитов, проявляющихся СКВ-подобными синдромами, у которых СН-50 значительно снижено или не определяется. Для получения достоверных данных необходима быстрая заморозка сыворотки крови пациентов либо непосредственное определение СН-50 в течение 2 часов после взятия крови. Обычные при рутинных исследованиях задержки являются основной причиной ложнозаниженных уровней СН-50.

    Иммунохимический анализ для определения отдельных компонентов системы комплемента в клинике чаще всего предполагает измерение содержания СЗ и С4. Снижение их уровня указывает на активацию классического пути или же на нарушение их синтеза печенью. Низкая концентрация СЗ при нормальном содержании С4 подтверждает активацию альтернативного пути системы комплемента. Нормальное содержание основных показателей системы комплемента приведено в табл. 22.

    Таблица 22. Нормальные уровни основных факторов комплемента Общая гемолитическая активность комплемента (СН-50) 60-150Ед/мл Фактор комплемента СЗ 0,75-1,65 г/л Фактор комплемента С4 0,14-054 г/л Продукт активации комплемента СЗd менее 150 мг/л Ингибитор С1 эстеразы (С1 INН) 0,15-0,35 г/л Нефритогенный фактор (СЗNef) и антитела к С1q в норме не определяются Таблица 23. Содержание факторов комплемента сыворотки при различных заболеваниях Пример заболевания СН50 С4 С3 Путь активации комплемента СКВ, криоглобулинемия, гипокомплементемический заскулит, Гр(+) сепсис, острый фульминантный некроз печени снижен снижен снижен Классический и альтернативный Кожные формы СКВ, болезнь плотных депозитов с СЗNeF, Гр(-) бактериемия снижен N снижен Альтернативный Ангионевротический отек (дефицит С1q ингибитора) снижен снижен N Классический Высокая активность РА повышен повышен повышен Острофазный ответ

    Основной целью измерения содержания и активности факторов комплемента заключается в мониторировании активности заболеваний, при которых потребление комплемента свидетельствуют об активности иммунокомплексных процессов, таких как СКВ, тяжелые инфекции и иммунокомплексные васкулиты (табл. 23).

    Выраженное снижение СЗ и С4 наблюдается при волчаночном гломерулонефрите, эссенциальной криоглобулинемии, гемолитической анемии, сепсисе, вызванном грамположительными микроорганизмами. Активация альтернативного пути комплемента с нормальным содержанием С4 характерна для грамотрицательной септицемии, диализа, острого гломерулонефрита и болезни плотных депозитов. Важно подчеркнуть, что многие другие формы поражения почек, в том числе IgА-нефропатия, пиелонефрит, синдром Гудпасчера, протекают при нормальном содержании факторов комплемента в сыворотке. В связи с индивидуальными вариациями содержания компонентов комплемента, для мониторирования активности заболевания необходимы серийные измерения СН50, С4 и СЗ.

    Падение концентраций компонентов комплемента в сыворотке свидетельствует об активном образовании иммунных комплексов в ткани. Восстановление нормального содержания факторов комплемента в сыворотке крови на фоне специфической терапии может быть использовано для контроля эфффективности лечения иммуно-комплексных заболеваний.

    Компоненты системы комплемента, такие как СЗ и С4, являются типичными острофазовыми реактантами, их содержание в сыворотке увеличивается при развитии иммунного воспаления. При РА и других артропатиях характерно увеличение содержания факторов комплемента в сыворотке крови, причем их концентрация коррелирует с клиническими индексами активности и другими лабораторными маркерами острофазного ответа. Эти изменения отражают синтез факторов комплемента печенью.

    Снижение содержания факторов комплемента в сыворотке крови больного с РА обычно связано с развитием васкулита. При васкулите на фоне РА основным является классический путь активации комплемента, сопровождающийся снижением СЗ, С4 и СН-50, увеличением содержания продуктов распада СЗ, таких как СЗd, и активационного индекса СЗd/СЗ. Снижение концентрации факторов комплемента приводит к уменьшению способности сыворотки растворять иммунные комплексы, а также к замедлению их элиминации из кровеносного русла. Это приводит к нарастанию содержания ЦИК в крови.

    В комплексной диагностике потребления факторов комплемента необходимо определение продуктов их распада. Это связано с тем, что синтез компонентов комплемента, как часть острофазных ответов, может усиливаться при воспалении, что может маскировать их потребление. Улучшение диагностической значимости достигается путем определения продуктов деградации факторов системы комплемента: С4а и СЗd для классического и альтернативного путей соответственно.

    Одной из причин снижения содержания факторов комплемента в сыворотке могут являться аутоантитела, направленные против факторов комплемента. Снижение С4 и СЗ, сопровождающееся клинической картиной рецидивирующего кожного геморрагического васкулита и артралгий у взрослых женщин, может быть проявлением гипокомплементемического васкулита, описанного в 1973 году Мак-Даффи (MacDuffie). У большинства этих больных отмечаются аутоантитела, направленные против С1q фактора классического пути комплемента. При биопсии кожи у этих больных можно обнаружить гранулярные отложения иммуноглобулинов под базальной мембраной и СЗ, IgG и фибрин в стенках сосудов. Антитела против С1q отмечаются у 40% пациентов с СКВ, преимущественно с волчаночным нефритом. Высокие титры этих аутоантител отмечаются у пациентов с диффузно-пролиферативным волчаночным гломерулонефритом, который характеризуется плохим прогнозом. Кроме СКВ и гипокомплементемического васкулита, антитела против С1q с разной частотой могут быть обнаружены при васкулите на фоне РА, синдроме Фелти и IgА-нефропатии.

    Антитела, направленные против факторов комплемента, встречаются при других аутоимунных заболеваниях. Нефритогенный фактор (СЗNef) является аутоантителом, направленным против СЗ-конвертазы, которое приводит к активации системы комплемента по альтернативному пути. Связывание СЗNef с СЗ-конвертазой приводит к стабилизации активности фермента и накоплению активи¬рованного СЗ. Присутствие СЗNef может быть обнаружено у больного с мезангиокапиллярным гломерулонефритом 1 типа (болезнью плотных отложений), который сопровождается низким содержанием СЗ фактора комплемента сыворотки крови при нормальной концентрации фактора С4.

    Измерение активности комплемента сыворотки позволяет выявлять врожденные дефекты компонентов системы комплемента. Дефицит ранних компонентов системы комплемента может приводить к сниженной способности устранения вирусных антигенов и склонности к иммунокомплексным заболеваниям. Гомозиготные дефициты компонентов комплемента являются крайне редкими, однако гетерозиготы с отсутствием одной аллели отмечаются часто и сопровождаются низкими уровнями факторов комплемента.

    Недостаточность С1, С4 и С2 проявляется волчаночноподобным заболеванием, сочетающим клиническую картину артралгий, гломерулонефрита с кожными проявлениями, васкулитом и лихорадкой. При селективном дефиците факторов классического пути повторные гнойные инфекции почти не наблюдаются, в отличие от наследственных комплементопатий, затрагивающих конечный путь активации комплемента. Эти формы врожденных энзимопатий проявляются обычно уже в раннем дошкольном возрасте. Так, дефицит СЗ является причиной повторных, часто жизнеугрожающих, бактериальных инфекций, таких как септицемия, пневмония и менингит. Врожденная недостаточность С5, С6, С7 и С8 сопровождается рецидивирующими гонококковыми инфекциями с септицемией и артритом, а также рецидивирующими пневмококковыми инфекциями. Наиболее важным признаком дефицита основных компонентов комплемента является абсолютное отсутствие титра комплемента СН-50, в то время как при болезнях потребления все же имеется определяемый уровень СН-50.

  • Белки острой фазы [показать]

    Мониторинг воспаления составляет одну из основных задач иммунологических тестов. Ревматические заболевания - хронические воспалительные заболевания, периоды обострений которых чередуются с периодами клинической ремиссии. Активная терапия на высоте воспалительного процесса позволяет предупредить развитие морфологических изменений в органах-мишенях и улучшить прогноз больного.

    Острофазный ответ представляет собой комплексное проявление активации различных механизмов иммунной системы. Он характеризуется выбросом цитокинов, экспрессией и секрецией множества других факторов, адгезионных молекул, стимуляцией пролиферативных процессов, появлением в кровотоке растворимых форм рецепторов и т.д. С диагностической точки зрения, наиболее удобным является мониторинг продукции белков воспаления, которые синтезируются печенью в больших количествах и могут быть обнаружены в сыворотке крови.

    Основными индукторами продукции факторов воспаления являются провоспалительные цитокины, такие как IL-1-бета, IL-6, вырабатываемые клетками ретикулярно-макрофагальной системы. Острофазный ответ чрезвычайно гетерогенен как по составу, так и по уровню синтеза воспалительных белков (рис. 14). Концентрация некоторых белков в ходе ответа увеличивается более чем на 50%. К ним относятся факторы комплемента, церрулоплазмин. Содержание таких реактантов, как фибриноген, гаптоглобин, возрастает в несколько раз. Надежно зарекомендовало себя в клинике определение С-реактивного белка и сывороточного амилоида А, уровни которых повышаются в сотни и тысячи раз.

    С-реактивный белок относится к семейству пентраксинов и представляет собой пентамер с молекулярной массой 105 кДа, который синтезируется только клетками печени. СРВ может связываться с полисахаридами и липидами клеточной стенки бактерии и способен активировать альтернативный путь активации комплемента, что приводит к опсонизации и фагоцитозу бактериальных клеток. СРВ представляет собой основной неспецифический тест оценки активности заболевания у больных с самыми разнообразными воспалительными процессами. Широкий разброс концентраций СРВ при разных состояниях позволяет использовать измерение СРВ для классификации, определения тяжести, прогноза и активности воспалительного процесса (табл. 24).

    Таблица 24. Увеличение концентрации СРВ при различных заболеваниях Норма, незначительное увеличение (4-10 мг/л) Умеренное повышение (10-100 мг/л) Выраженное повышение (> 100 мг/л) Физическая нагрузка
    Простуда
    Беременность
    Нестабильная стенокардия Инфаркт миокарда
    Опухоли
    Панкреатит
    ДБСТ Острые бактериальные инфекции (сепсис)
    Значительная травма
    Системные васкулиты Таблица 25. Значение определения СРВ и СОЭ при основных ревматических заболеваниях Заболевание Значение РА Активность воспаления, плохой прогноз.

    Снижение показателей указывает на успех противовоспалительной терапии

    СКВ Высокое СОЭ, низкие концентарции СРВ.

    Увеличение концентрации СРВ - инфекционные осложнения

    Височный артериит
    Ревматическая полимиалгия
    Болезнь Такаясу Высокое СОЭ и СРВ входят в критерии диагноза

    Методом выбора для измерения СРВ является иммунохимическое определение, с получением количественного результата. У большинства здоровых лиц средняя концентрация СРВ в сыворотке крови составляет 800 мкг/мл. Сывороточные концентрации между 10 и 40 мг/мл отмечаются при умеренном воспалении, соответствующем неосложненным вирусным инфекциям. У больных с аутоиммунными заболеваниями содержание СРВ в сыворотке составляет 40-100 мг/л, в то время как концентрации, превышающие 100 мг/л, свидетельствуют о тяжелых септических процессах. При ожогах и сепсисе концентрации СРВ могут достигать 300 мг/л и более.

    СРВ является очень чувствительным острофазовым маркером, и его колебания позволяют оценить тяжесть инфекционного процесса. Определение СРВ информативно в качестве скринингового теста, позволяющего выявлять острое воспаление. По сравнению с СОЭ увеличение СРВ сыворотки крови значительно чаще свидетельствует об органической природе заболевания, в то время как диагностическая значимость определения СОЭ очень мала. Увеличение СОЭ может быть использовано для подтверждения клинически обоснованного диагноза, но не дает достаточных оснований для проведения диагностического поиска при отсутствии сложившейся клинической картины. Мониторинг СОЭ может служить мерой эффективности иммуносупрессивной терапии. Таким образом, данные исследований СРВ и СОЭ должны рассматриваться одновременно.

    Мониторирование концентрации СРВ и СОЭ необходимо при РА (табл. 25). Они отражают активность воспалительного процесса и обычно характеризуют эффективность противовоспалительной терапии у этих больных. Больные, у которых дебют РА сопровождается высокой активностью воспалительного процесса, имеют худший прогноз в отношении деструкции суставов и нуждаются в активной терапии.

    При СКВ увеличенное СОЭ сопровождается низкими концентрациями СРВ. Увеличение концентрации СРВ у больного СКВ свидетельствует о наличии вторичного инфекционного процесса. Нейтрофильный лейкоцитоз часто отмечается при системных заболеваниях соединительной ткани и васкулитах, что нередко приводит к ошибочному поиску инфекционного процесса. Содержание СРВ, превышающее 100 мг/л, позволяет дифференцировать инфекционную и аутоиммунную этиологию процесса. Концентрация СРВ больше 100 мг/л с высокой вероятностью указывает на инфекцию и опровергает диагноз возможного системного заболевания.

    Несомненное значение имеет определение СРВ при системных васкулитах, прежде всего при гигантоклеточном артериите, ревматической полимиалгии, а также гранулематозных васкулитах и воспалительных заболеваниях кишечника. На сегодняшний день измерение СРВ можно рассматривать в качестве основного метода оценки активности иммунной системы. Иммунологическое обследование больного с ревматологическим заболеванием должно обязательно включать измерение концентрации СРВ в сыворотке крови и повторяться с регулярными интервалами времени для наблюдения за ходом заболевания.

Перспективы использования новых острофазных реактантов

Ведется активный поиск универсальных серологических маркеров активности воспалительных заболеваний. На эту роль претендуют различные ферменты иммунокомпетентных клеток, продукты их метаболизма и деградации. На сегодняшний день наиболее изученным продуктом активации иммунокомпетентных клеток являются растворимые клеточные рецепторы, среди которых одну из ведущих позиций занимает sIL2R.

Молекула sIL2R представляет собой растворимую форму клеточного рецептора к Il-2, который экспрессируется в процессе активации на поверхности лимфоцитов. Он образуется как в результате слущивания поверхностных молекул лимфоцитов, так и в ходе непосредственной секреции молекулы рецептора в межклеточное пространство и кровь. Функции растворимой формы рецептора IL-2 в организме окончательно не установлены. Предполагается, что sIL2R в циркуляции может связывать излишки цитокина и выполнять роль сывороточного депо этого фактора.

Интерес к определению этого маркера в клинике порожден тем фактом, что sIL2R - это прямой показатель вовлеченности механизмов клеточного иммунитета, отражающий активацию лимфоцитов. Кроме того, удобство его обнаружения в сыворотке крови, по сравнению с тестами in vitro, делает sIL2R весьма привлекательным для оценки клеточного иммунитета. Действительно, увеличение его содержания в сыворотке крови отмечается при подавляющем числе заболеваний, сопровождающихся иммунным ответом.

Значительное увеличение sIL2R в сыворотке отмечается у больных с системными заболеваниями соединительной ткани, рассеянном склерозе, при инфекционных и вирусных заболеваниях, онкопатологии, у больных, подвергающихся гемодиализу. У больных СКВ уровни sIL2R сыворотки коррелируют с активностью заболевания и рядом лабораторных маркеров, в частности с высоким содержанием антител к дсДНК, повышенным СОЭ и низким содержанием факторов комплемента.

При ревматоидном артрите содержание sIL2R достоверно выше нормальных значений как в сыворотке крови, так и в синовиальной жидкости, причем концентрация маркера зависит от активности и длительности заболевания. У больных с высоким содержанием sIL2R клинические показатели активности заболевания и его прогноз значительно хуже. Попытки использования sIL2R в качестве основного критерия активности заболевания показали его низкую специфичность по сравнению с клиническими индексами. Возможным объяснением этому является то, что его содержание выше в начале заболевания и несколько снижается при длительном течении артрита. У большинства больных с жалобами на суставные боли без деструкции сустава и высоким содержанием sIL2R ревматоидный артрит развивается в течение года. Обнаружение СРВ больше 10 мг/л, sIL2R больше 100 пмоль/л и РФ выше 30 IU/мл позволяет поставить диагноз доклинического РА со специфичностью около 95% и чувствительностью около 70%.

У больных с РА sIL2R хорошо коррелирует с содержанием других маркеров острого воспаления, в частности СРВ, СОЭ, IgG и СЗ. Уровень sIL2R не позволяет установить точную природу воспалительного артрита, что позволяет отнести sIL2R к неспецифическим маркерам воспаления.

Измерение концентраций sIL2R в сыворотке отражает активность заболевания при АНЦА-ассоциированных васкулитах. Содержание sIL2R значительно выше у больных с активным генерализованным васкулитом, чем у больных с нечеткой клинической картиной и неактивным процессом. У ряда больных в стадии ремиссии сохраняются высокие уровни sIL2R, несмотря на нормализацию других показателей активности, в частности СРВ и АНЦА. У этой категории больных наблюдается высокий риск развития обострений ГВ.

Повышенная концентрация sIL2R отмечается при активном ГВ, с низким титром АНЦА и СРВ. Таким образом, уровни sIL2R коррелируют с активностью заболевания и высокое содержание при неактивном ГВ прослеживается у больных с высоким риском развития рецидивов. Содержание sIL2R значительно выше нормы у больных с ревматической полимиалгией и височным артериитом, причем наблюдается достоверная корреляция между его содержанием, содержанием СРВ и СОЭ. Концентрация sIL2R снижается при успешной иммуносупрессивной терапии, но сохраняется повышенной по сравнению со здоровыми, что, по всей видимости, отражает текущую Т-клеточную активацию, даже несмотря на отсутствие клинических проявлений.

Исследуется возможность использования sIL2R для контроля за эффективностью проводимой иммуномодулирующей терапии. Например, терапия РА глюкокортикоидами, циклоспорином А и внутривенным человеческим иммуноглобулином приводит к нормализации его содержания в сыворотке в течение нескольких месяцев после начала терапии. Динамика sIL2R не коррелирует с клиническим эффектом от препаратов второй линии, таких как гидроксихлорокин, сульфасалазин и метотрексат. По всей видимости, это объясняется преимущественно противовоспалительным действием этих препаратов. Результат их применения отражается на непосредственных маркерах воспалительной реакции, таких как СРВ, СОЭ и IL-6.

Кроме растворимых рецепторов цитокинов и растворимых молекул адгезии, перспективно применение с диагностической целью растворимых форм других клеточных рецепторов. Среди них особое внимание привлекают sСD4 и sСD8. Эти молекулы, циркулирующие в кровотоке в свободной форме, также являются последствием активации основных популяций Т-лимфоцитов. Изменение концентрации растворимых рецепторов отражает активность того или иного вида клеток, указывая на путь развития иммунного ответа. Так, СКВ сопровождается увеличением содержания sСD4 и sСD8, что указывает на активацию Т-клеточного иммунитета, протекающего на фоне выраженного гуморального ответа. Хотя практические аспекты определения растворимых форм лимфоцитарных рецепторов еще не изучены в достаточной степени, их обнаружение позволяет выявлять важные патогенетические механизмы аутоиммунных заболеваний.

Измерение содержания СРБ при аутоиммунных заболеваниях может быть дополнено определением прокальцитонина - острофазового реактанта, способного установить инфекционную этиологию. Важность исследований в этом направлении определяется высокой частотой острых инфекционных заболеваний у иммуносупрессированных больных. Содержание прокальцитонина при активной СКВ и АНЦА-ассоциированных васкулитах находится в границах нормы, несмотря на увеличенное содержание других маркеров активности, таких как СРБ, неоптерин и IL-6. Развитие системной инфекции приводит к выраженному повышению содержания прокальцитонина в сыворотке крови.

Измерение содержания цитокинов в сыворотке представляет одну из потенциальных возможностей оценки воспалительных реакций. Действительно, они являются основными медиаторами иммунного ответа, во многом определяя его направление. Их соотношение и динамика их содержания теоретически позволяют описать иммунный статус и определить фазу и прогноз заболевания. В качестве упрощенного подхода для интерпретации содержания цитокинов можно воспользоваться следующей классификацией их активности. IL-6, IL-8, IL-1-бета, IL-2, ТNF-альфа представляют собой основные провоспалительные цитокины, отражающие активность неспецифического иммунитета и пролиферативных процессов. Баланс гуморального и клеточного иммунитета определяется концентрациями таких цитокинов, как IFN-гамма, IL-12, отражающих стимуляцию цитотоксических лимфоцитов, опосредованную Тh1, а с другой стороны, IL-4, IL-5, IL-10, указывающих на активность гуморального иммунитета и, соответственно, Th2. IL-10 и ТGF-бета являются основными противовоспалительными цитокинами, способными подавить развитие специфического иммунного ответа.

Исследование цитокинового "статуса", то есть прямое измерение концентрации цитокинов в сыворотке крови пациентов, при ревматологических заболеваниях выявило множество сдвигов в иммунной системе у этих больных. Несмотря на это, клиническое применение измерения цитокинов сыворотки очень ограниченно. Диапазон сывороточных концентраций цитокинов сравнительно невелик, в отличие, например, от острофазовых реактантов или аутоантител. Время жизни этих факторов в циркуляции мало, цитокины нередко сорбированы на сывороточных белках, связаны с растворимыми формами рецепторов и поверхностью клеток.

Часто интерлейкины и растворимые клеточные рецепторы отражают персистирующую активацию иммунной системы, что не позволяет отличить острую инфекцию от хронической и обострение от ремиссии. Низкая информативность наряду с дороговизной определения сывороточных цитокинов делают исследование цитокинового статуса ограниченным для практической работы. Цитокины осуществляют преимущественно паракринные взаимодействия и содержание большинства из них в системной циркуляции очень непостоянно и рассматривается как вторичное явление.

Диагностическое значение определения цитокинов возрастает при их исследовании непосредственно в очаге специфического воспалительного процесса. С этой целью используется определение цитокинов в жидкостях полостей и секретах, таких как синовиальная и цереброспинальная жидкость, слюна, моча, отделяемое из хирургических дренажей.

В связи с этими особенностями действия цитокинов, их концентрация в биологических жидкостях, таких как спинномозговая или синовиальная, имеет большую ценность по сравнению с определением цитокинов в сыворотке крови. Например, при васкулитах центральной нервной системы определение IL-6 в цереброспинальной жидкости лучше отражает активность заболевания, по сравнению с концентрацией того же цитокина в сыворотке крови.

1   2   3   4


 
 

Куда пойти учиться


 

Виртуальные консультации

На нашем форуме вы можете задать вопросы о проблемах своего здоровья, получить поддержку и бесплатную профессиональную рекомендацию специалиста, найти новых знакомых и поговорить на волнующие вас темы. Это позволит вам сделать собственный выбор на основании полученных фактов. Медицинский форум КОМПАС ЗДОРОВЬЯ

Обратите внимание! Диагностика и лечение виртуально не проводятся! Обсуждаются только возможные пути сохранения вашего здоровья.

Подробнее см. Правила форума  

[X]

Беседы с опытным психологом по Skype. Консультации, психотерапия.

Стоимость 1 часа - 500 руб. (с 02:00 до 16:00, время московское)

С 16:00 до 02:00 - 800 р/час.

E-mail:

Последние сообщения


Реальные консультации


Реальный консультативный прием ограничен.

Ранее обращавшиеся пациенты могут найти меня по известным им реквизитам.

Заметки на полях


навязывание услуг компании Билайн, воровство компании Билайн

Нажми на картинку -
узнай подробности!

Новости сайта

Ссылки на внешние страницы


20.05.12

Уважаемые пользователи!

Просьба сообщать о неработающих ссылках на внешние страницы, включая ссылки, не выводящие прямо на нужный материал, запрашивающие оплату, требующие личные данные и т.д. Для оперативности вы можете сделать это через форму отзыва, размещенную на каждой странице.
Ссылки будут заменены на рабочие или удалены.

Тема от 05.09.08 актуальна!


Остался неоцифрованным 3-й том МКБ. Желающие оказать помощь могут заявить об этом на нашем форуме 05.09.08
В настоящее время на сайте готовится полная HTML-версия МКБ-10 - Международной классификации болезней, 10-я редакция.

Желающие принять участие могут заявить об этом на нашем форуме

25.04.08
Уведомления об изменениях на сайте можно получить через раздел форума "Компас здоровья" - Библиотека сайта "Островок здоровья"

Островок здоровья  
Источник: http://bono-esse.ru/blizzard/Lab/Immuno/immun_labDS_revmaticheskih_zabolevanij_3.html


Поделись с друзьями



Рекомендуем посмотреть ещё:



Sredstva Через какое время можно узнать о беременность

Беременность с фосфолипидным синдромом Беременность с фосфолипидным синдромом Беременность с фосфолипидным синдромом Беременность с фосфолипидным синдромом Беременность с фосфолипидным синдромом Беременность с фосфолипидным синдромом Беременность с фосфолипидным синдромом Беременность с фосфолипидным синдромом Беременность с фосфолипидным синдромом

ШОКИРУЮЩИЕ НОВОСТИ